通过去甲基化酶介导的表观遗传重激活增强化学动力学癌症治疗的复合纳米囊泡

《Journal of Controlled Release》：Composite nanovesicles for enhanced chemodynamic cancer therapy via decitabine-mediated epigenetic reactivation

化学动力治疗协同表观遗传重编程通过纳米递送系统增强抗肿瘤免疫应答。PLMD纳米颗粒通过多亲水/疏水聚合物自组装实现药物共递送，其中β- Lapachon和Mn2?介导的Fenton反应放大ROS生成，激活cGAS-STING通路并诱导线粒体损伤释放mtDNA，同时DNA甲基转移酶抑制剂Decitabine通过去甲基化恢复STING和GSDME表达，将凋亡转为炎症小体Pyroptosis，促进树突状细胞成熟和T细胞活化，显著抑制4T1肿瘤生长。

　　

赵新晨|邱丽艳

中国浙江省杭州市浙江大学高分子科学与工程学院，教育部重点实验室（大分子合成与功能化），邮编310058

摘要

化学动力学疗法（CDT）已被广泛用于治疗各种实体瘤。然而，其疗效受到活性氧（ROS）生成不足和关键免疫调节基因表观遗传沉默的严重限制。在此，我们开发了一种复合纳米载体（PLMD），将CDT与表观遗传重编程相结合，以协同激活cGAS-STING通路并诱导焦亡。PLMD通过两亲性聚合物自组装和唾液酸表面修饰构建，以提高肿瘤靶向性，实现β-拉帕酮（Lap）、Mn²⁺和地西他滨（Dac）在肿瘤细胞中的协同递送，并在酸性及羧酸酯酶作用下释放这些物质。Lap在NQO1过表达的肿瘤细胞中选择性生成H₂O₂，与Mn²⁺介导的芬顿反应协同作用，增强细胞内ROS水平，诱导线粒体损伤并促进细胞质线粒体DNA（mtDNA）释放。Mn²⁺进一步增强cGAS对DNA的敏感性，从而强烈激活cGAS-STING信号通路。同时，内在凋亡通路的激活导致gasdermin E（GSDME）被caspase-3切割，进而引发焦亡。此外，Dac通过DNA去甲基化恢复STING和GSDME的表达，显著增强cGAS-STING的激活和焦亡效应。结果，在4T1肿瘤模型中，PLMD治疗显著抑制肿瘤生长并引发强烈的抗肿瘤免疫反应。

引言

化学动力学疗法（CDT）由Bu和Shi团队于2016年首次提出，已成为一种有前景的癌症治疗策略[1]、[2]。CDT依赖于过渡金属离子（如Fe²⁺、Cu⁺和Mn²⁺）催化的芬顿或类芬顿反应，将内源性过氧化氢（H₂O₂转化为高细胞毒性的羟基自由基（•OH），从而引发严重的氧化应激和对关键细胞成分的不可逆损伤[3]、[4]。利用肿瘤微环境（TME）的病理特征（包括微酸性及较高的H₂O₂水平），CDT能够选择性地对肿瘤进行氧化损伤，因此表现出相对较低的系统性毒性[5]、[6]。与光动力疗法不同，CDT不依赖耗氧的光物理过程或外部光照，因此其治疗效果不受肿瘤缺氧或光穿透深度的限制[7]。由于这些优势，CDT已被广泛用于治疗多种实体瘤[8]、[9]、[10]、[11]。

除了直接的细胞毒性外，CDT过程中产生的过量活性氧（ROS）还可以作为信号介质，激活参与免疫调节的多种炎症通路[12]、[13]。特别是，丰富的ROS可导致严重的线粒体功能障碍，使线粒体DNA（mtDNA）泄漏到细胞质中，这成为激活cGAS-STING通路及随后I型干扰素（IFN）信号通路的主要诱因[14]、[15]、[16]、[17]。此外，ROS诱导的线粒体损伤可激活内在凋亡通路，引发效应蛋白酶caspase-3的级联激活[18]。值得注意的是，在表达gasdermin E（GSDME）的肿瘤细胞中，激活的caspase-3会切割GSDME，释放其孔形成N端片段（GSDME-N），从而将凋亡转化为焦亡[19]。作为一种高度免疫原性的程序性细胞死亡形式，焦亡促进促炎介质和肿瘤相关抗原的释放，最终增强抗肿瘤免疫反应[20]、[21]。

然而，CDT的疗效受到肿瘤细胞内内源性H₂O₂水平不足的限制，这凸显了需要设计具有增强ROS生成能力的纳米平台[22]、[23]、[24]、[25]。此外，肿瘤经常通过表观遗传机制沉默免疫调节基因，可能进一步削弱抗肿瘤免疫反应[26]、[27]、[28]。作为先天免疫激活的核心信号枢纽，STING在多种肿瘤类型中常因启动子高甲基化而受到表观遗传下调，从而减弱氧化应激诱导的先天免疫反应[29]、[30]、[31]、[32]。同时，GSDME也常因启动子高甲基化而被抑制，使ROS诱导的细胞死亡偏向于免疫原性较低的凋亡模式而非焦亡[33]、[34]。

为克服这些限制，我们提出了一种结合β-拉帕酮（Lap）、锰离子（Mn²⁺和地西他滨（Dac）的策略，以同时增强CDT的疗效并放大其免疫调节效果。Lap是一种有前景的临床抗癌候选物，可通过NAD(P)H:醌氧化还原酶1（NQO1）催化的氧化还原循环持续生成H₂O₂[35]。鉴于NQO1在多种实体瘤中过表达，Lap能够选择性地增强细胞内H₂O₂水平，为CDT介导的•OH生成提供持续的底物供应[36]、[37]。高效的CDT需要过渡金属离子来催化芬顿或类芬顿反应；其中，Mn²⁺不仅作为类芬顿催化剂增强ROS生成，还作为cGAS-STING信号的强效增强剂。具体而言，Mn²⁺提高了cGAS的DNA结合亲和力和催化活性，即使在细胞质DNA水平较低时也能实现强效的cGAMP生成，同时稳定cGAMP-STING相互作用，放大下游I型IFN信号[38]。更重要的是，Dac作为一种临床批准的DNA甲基转移酶抑制剂，可逆转异常的启动子高甲基化，恢复表观遗传沉默基因（包括STING和GSDME）的转录，从而增强CDT引发的先天免疫激活，并使caspase-3介导的凋亡向高度免疫原性的焦亡转变[39]、[40]、[41]、[42]。

基于这些发现，我们合理设计了基于两亲性聚合物PEAMP的复合纳米载体PLMD，用于协同递送Lap、Mn²⁺和Dac（图1）。PEAMP自组装成具有疏水膜和亲水核心的纳米载体，使疏水的Lap封装在膜中，亲水的Dac封装在水分内部。单宁酸（TA）作为多酚螯合剂与Mn²⁺结合，在核心形成TA-Mn²⁺交联网络。为了提高肿瘤内积累，纳米载体表面经过唾液酸（SA）修饰，SA可与某些肿瘤细胞上上调的Siglec家族成员相互作用，从而促进纳米颗粒的细胞内化[43]、[44]。已有研究表明，SA修饰的纳米颗粒在4T1三阴性乳腺癌模型中表现出增强的细胞摄取和肿瘤富集效应[45]、[46]。此外，PEAMP在胞内/溶酶体区室中可被羧酸酯酶（CES）降解，酸性条件有助于TA-Mn²⁺复合物的解离，从而加速药物在细胞内的释放。Dac有效恢复了4T1肿瘤细胞中STING和GSDME的表达，增强了其对cGAS-STING激活和焦亡的敏感性。最终，PLMD纳米载体在体外和体内均表现出强烈的抗肿瘤效果，并引发了强烈的免疫激活，显示出作为增强CDT基癌症免疫治疗的综合纳米治疗策略的潜力。

合成所用化学试剂

甲氧基聚乙二醇（mPEG，Mn = 2000）、4-硝基苯氯甲酸和膦腈三聚体购自Sigma-Aldrich；三氟乙酸（TFA）和氯化铝（AlCl₃购自Adamas；胆固醇-PEG-NH₂（Chol-PEG-NH₂，Mn = 3400）购自广州卫华生物技术；SA、N-(3-二甲氨基丙基)-N′-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC·HCl）和N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）购自Aladdin。

PEAMP和Chol-PEG-SA的合成与表征

PEAMP通过依次接枝亲水性mPEG-NH₂和疏水性AMEM到聚二氯磷杂苯上合成，采用优化的投料比。¹H NMR谱确认了mPEG-NH₂的成功合成，其末端甲氧基（OCH₃）在δ 3.37 ppm处被识别（图S4）。在PEAMP的¹H NMR谱中，δ 3.45–3.83 ppm（OCH₂CH₂）和δ 3.38 ppm（OCH₃）处的特征信号归因于mPEG-NH₂，δ 1.86 ppm处的峰归属于甲基（CH₃

结论

总之，PLMD结合了Lap/Mn²⁺介导的CDT和Dac介导的表观遗传重编程，以增强肿瘤免疫治疗。得益于SA表面修饰和pH/CES响应的药物释放，PLMD能够高效地将治疗剂共递送到肿瘤内部，同时保持良好的生物相容性。机制上，Lap和Mn²⁺协同增强肿瘤细胞中CDT诱导的ROS生成，导致线粒体损伤、mtDNA释放和caspase-3激活。

CRediT作者贡献声明

赵新晨：撰写初稿、方法学设计、实验研究、数据分析、概念构建。 邱丽艳：撰写修订稿、监督工作、项目管理、资金申请、概念构思。

利益冲突声明

作者声明没有利益冲突。

致谢

本工作得到了国家自然科学基金（编号：82273883）的资助。我们感谢浙江大学医学院核心设施的黄英英和郭春在技术上的支持，以及浙江大学高分子科学与工程学院测试与分析中心的张英英和张新宁在技术上的协助。