《Journal of Controlled Release》：A resveratrol dimer nanoagent boosts sonodynamic-immunotherapy
via suprathreshold autophagy
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本研究开发了一种基于ROS响应的雷帕霉素二聚体（RTR）纳米剂，通过组装氯靛红和磷脂形成稳定递送系统，精准释放药物于肿瘤微环境，诱导超阈值自噬（SA）和免疫原性细胞死亡（ICD），显著增强小鼠乳腺癌模型的抗肿瘤免疫应答。
杨楠|范忠雄|朱福凯|李建民|王庆洛|夏国宇|于书杰|丁丽军
新疆大学药学院，药物研究所，乌鲁木齐830017，中国
摘要
超阈值自噬（SA）诱导的免疫细胞死亡（ICD）已成为癌症免疫治疗中的一种有前景的策略。声动力疗法（SDT）产生的活性氧（ROS）风暴因其增强自噬的潜力而受到了广泛关注。然而，由于ROS生成不足且短暂，调节自噬的能力仍然受到限制，从而削弱了ICD的反应。因此，打破细胞内的自噬阈值对于放大SDT的免疫治疗效果至关重要。在这里，通过使用硫酮（TK）作为可切割连接剂，合成了一种对ROS响应的白藜芦醇（Res）二聚体（Res-TK-Res，RTR），以实现自噬诱导剂的精确释放。在精确的弱相互作用介导的超分子识别驱动下，客体分子Chlorin e6（Ce6）和RTR与宿主分子磷脂（PC）结合，通过共溶剂法形成基于PC的包合物。随后，基于这种包合物，通过自组装策略构建了一种稳定的纳米剂。研究发现，这种纳米剂具有出色的稳定性和良好的生物相容性，在肿瘤内源性ROS的刺激下，能够在肿瘤部位精确释放Res和Ce6，诱导SA，促进ICD，并增强抗肿瘤免疫反应。值得注意的是，该纳米剂能够显著上调LC3B表达，从而在小鼠乳腺癌模型中体内发挥显著的抗肿瘤效果。重要的是，这种纳米剂不仅可以解决SDT在调节自噬方面的各种局限性，还可以提供一种基于SDT和SA诱导ICD的新颖转移性癌症免疫治疗方法。
引言
最近，作为一种独特的自噬激活模式，超阈值自噬（SA）受到了广泛关注[1]。众所周知，SA通常由严重的氧化应激触发。此外，SA的特点是自噬通量的持续过度激活，超过生理阈值并破坏细胞稳态[2]。在生理水平上，自噬可以被视为一种重要的细胞自我保护机制。它通过隔离和降解受损的细胞器、蛋白质以及其他细胞成分来应对外部压力[3]。这一过程有助于维持细胞内稳定性。例如，自噬可以保持线粒体的完整性，并在肿瘤细胞中维持生物能量平衡，从而支持与生长和增殖相关的代谢需求[4]。从保护性自噬向SA的转变由自噬通量与细胞耐受能力之间的动态平衡所决定。当压力处于可逆范围内时，自噬有助于恢复稳态。然而，一旦压力超过这一临界阈值，自噬活性会持续增强，导致细胞器逐渐耗尽、代谢崩溃，最终导致细胞死亡。虽然生理自噬具有细胞保护作用，但SA通过过度降解细胞内成分来促进不可逆的肿瘤细胞死亡[2]。此外，SA已被证明可以触发免疫细胞死亡（ICD），激活抗肿瘤免疫反应[5]。上述发现为开发新的肿瘤免疫治疗策略提供了重要的理论基础[6]。因此，通过物理疗法或药物干预精确调节自噬已成为当代癌症研究的主要焦点[7]。
声动力疗法（SDT）诱导的活性氧（ROS）的增加已成为自噬调节的关键机制[8]、[9]、[10]。作为一种非侵入性治疗方式，SDT利用特定频率的超声波（US）实现深层组织穿透，其中声空化和机械力直接破坏癌细胞[11]。治疗效果主要通过US激活的声敏剂引发的细胞应激反应来介导，导致ROS的大量生成和随后的ICD诱导[12]、[13]、[14]、[15]、[16]。然而，声敏剂产生的ROS也可以在肿瘤细胞中激活细胞保护性自噬[17]、[18]。这种适应性反应不仅促进了肿瘤细胞的存活，还降低了SDT的整体治疗效果[19]。因此，为了增强SDT的抗肿瘤效果，必须精确调节自噬活性，并将其驱动超过细胞保护阈值以在肿瘤细胞中诱导SA[20]、[21]。SDT介导的ROS积累会导致明显的氧化应激，这是ICD的关键上游信号[22]。过高的ROS水平可以进一步促进损伤相关分子模式（DAMPs）的释放或表面暴露，包括高迁移率盒1（HMGB1）、细胞外三磷酸腺苷（ATP）和钙网蛋白（CRT），从而增强肿瘤的免疫原性[23]、[24]、[25]。此外，当自噬活性超过生理阈值时，SA可以促进免疫刺激分子的释放，包括ATP、HMGB1、CRT和热休克蛋白（HSPs）[26]、[27]。这些危险信号可以促进树突状细胞（DC）的激活和免疫细胞的招募，最终增强ICD反应[28]、[29]、[30]、[31]、[32]。ICD代表了一种免疫刺激性的调节性细胞死亡类型，它不仅可以消灭肿瘤细胞，还可以通过释放或暴露DAMPs来激发强烈的抗肿瘤免疫反应，从而增强免疫识别和清除恶性细胞[33]、[34]、[35]。因此，利用SDT过程中产生的ROS来激活免疫反应，并通过将自噬活性驱动超过细胞保护阈值来进一步增强ICD，为癌症治疗提供了一种有前景的治疗策略。然而，SDT调节自噬的能力仍然有限。因此，必须在SDT过程中进一步放大自噬活性，超过一个临界阈值才能有效触发ICD[36]。
鉴于这些考虑，本研究旨在通过加入自噬诱导剂来在SDT过程中增强ICD。选择白藜芦醇（Res）是因为其已被证明能够激活癌细胞的自噬信号通路并增强自噬通量[37]。当自噬活性超过生理阈值时，SA可以驱动自噬细胞死亡并增强ICD[5]。然而，如Chlorin e6（Ce6）和Res等关键药物的治疗效果受到其较差的水溶性和低生物利用度的限制[38]。为了克服这些限制，开发了一种基于Res二聚体的纳米剂，以实现可控的药物释放和改善的药代动力学性能。在设计了利用硫酮（TK）作为可切割连接剂的ROS响应型Res二聚体（Res-TK-Res，RTR）后，TK中的C
S键可以在肿瘤微环境（TME）中高ROS水平下选择性切割，从而实现按需药物释放[39]。随后，RTR与Ce6和磷脂（PC）通过超分子相互作用共组装成纳米剂（RCP）。这种纳米剂提高了疏水性药物的溶解性和稳定性，同时实现了在TME中的ROS触发药物释放。通过将SDT诱导的ROS生成与SA诱导相结合，RCP纳米剂为放大ICD和激活抗肿瘤免疫反应提供了一种有前景的策略（见图1）。
RTR二聚体的合成与特性
为了在病变部位实现Res的可控释放，设计了一种对ROS响应的药物二聚体RTR，其中使用了TK连接剂。RTR是通过1-乙基-3-（二甲基氨基丙基）碳二亚胺盐酸盐（EDC·HCl）和4-二甲基氨基吡啶（DMAP）催化的酯化反应合成的，使得一个TK分子与两个Res分子结合（图S1）。通过傅里叶变换红外光谱（FT-IR）对RTR的化学结构进行了确认
结论
本研究揭示了SA可以与SDT协同作用，增强ICD，从而改善抗肿瘤效果。为此，设计了一种对ROS响应的Res二聚体（RTR），并进一步与Ce6和PC共组装成纳米剂RCP。得益于PC的两亲性质，RCP采用了核壳结构，其中疏水核心容纳药物载荷，而亲水外层有助于维持胶体稳定性。
作者贡献声明
杨楠：撰写——原始草稿，数据管理，概念化。范忠雄：撰写——原始草稿，监督，资金获取，数据管理，概念化。朱福凯：软件开发。李建民：数据管理。王庆洛：形式分析。夏国宇：数据管理。于书杰：数据管理。丁丽军：形式分析。
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的可能会影响本文所述工作的竞争性财务利益或个人关系。
致谢
本工作得到了新疆维吾尔自治区基础研究基金研究项目-培养项目（XJEDU2023P017）、国家自然科学基金（82560364）、新疆维吾尔自治区重点研发计划（2023B02030-1和2024B03039-2）以及2024 新疆维吾尔自治区研究生科学研究创新项目（XJ2024G080）的资助。所有动物实验均按照相关规范进行
