《Journal of Controlled Release》：Nano-sized DNase scavenges cell-free DNA for acute lung injury treatment
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急性肺损伤（ALI）中细胞游离DNA（cf-DNA）通过激活TLR9-NF-κB通路加剧炎症，本研究开发基于胆绿素（BR）的纳米酶系统BRn@DNase I，通过PEG修饰增强稳定性和肺靶向性，在ROS富集环境中BR氧化维持DNase活性并缓解氧化应激，有效清除cf-DNA、抑制炎症介质并促进巨噬细胞向修复型M2表型转化，为ALI治疗提供新策略。
陈瑞杰|徐一天合|叶展正|朱奕轩|张梦雪|吕芳芳|王云志|狄新宇|林银浩|宋胜楠|黄志豪|李世泽|何志楠|张海林|寇龙发
中国温州市325027，温州医科大学第二附属医院及玉英儿童医院药学系，温州市儿科药学重点实验室
摘要
受损细胞释放过多的游离DNA（cf-DNA）会激活DNA传感器，引发强烈的炎症反应，从而促进急性肺损伤（ALI）的发病机制。为了解决这一问题，我们开发了一种纳米级的DNase系统，通过将DNase I与PEG化的胆红素（BR）纳米颗粒（BRn@DNase I）结合，以有效清除cf-DNA并缓解炎症。将DNase I固定在纳米颗粒表面可以提高其稳定性、在肺部的滞留时间以及清除DNA的效率。在典型的炎症肺组织中，富含活性氧（ROS）的环境下，疏水性的BR会氧化成亲水性的胆绿素，导致纳米结构解体，同时保留DNase残留物的酶活性。此外，BR的抗氧化特性也增强了BRn@DNase I的保护作用。体外实验表明，BRn@DNase I显著抑制了活化巨噬细胞产生的促炎细胞因子。在LPS诱导的ALI小鼠模型中，该系统有效降低了肺部cf-DNA水平，减轻了炎症，并加速了组织恢复。值得注意的是，BRn@DNase I还调节了肺泡巨噬细胞的极化，使其从促炎的M1型转变为修复型的M2型。这些发现表明，BRn@DNase I是一种有前景的纳米治疗策略，可用于缓解ALI中的cf-DNA介导的炎症。
引言
急性肺损伤（ALI）是一种危及生命的呼吸系统疾病，其特征是发病迅速、肺功能障碍和严重的低氧血症。其常见病因包括创伤、严重感染、败血症和肺炎[1]、[2]、[3]、[4]。目前的临床治疗方法（如呼吸支持和液体管理）主要是对症治疗，未能解决潜在的炎症病理，导致死亡率持续高达40-60%[5]。
ALI发病机制的核心是免疫反应失调，导致过度炎症。在关键的炎症介质中，来自坏死或凋亡细胞的游离DNA（cf-DNA）作为损伤相关分子模式（DAMP），越来越被认为是炎症的强大驱动因素[6]、[7]。cf-DNA中的低甲基化CpG基序会激活Toll样受体9（TLR9），触发下游NF-κB信号通路并放大炎症级联反应。最近的研究证实，cf-DNA在ALI进展中起着致病作用，特别是在LPS刺激下释放线粒体DNA（mtDNA）后，会激活TLR9依赖的损伤过程[8]、[9]、[10]、[11]。值得注意的是，输注的红细胞能够清除cf-mtDNA，从而减轻肺部炎症[12]。
在cf-DNA清除方面，出现了两种主流方法：（i）使用阳离子材料的静电隔离；（ii）使用基于DNase的系统进行酶降解。阳离子聚合物主要通过电荷相互作用结合cf-DNA，可以快速中和由cf-DNA引发的信号传导[13]、[14]、[15]、[16]。然而，它们广泛的电荷相互作用有时可能导致与细胞成分或血清蛋白的非特异性结合，这对长期生物相容性和临床应用带来挑战。DNase I是一种重组内切酶，已被批准用于囊性纤维化的临床治疗，为cf-DNA降解提供了有前景的方法[17]、[18]。然而，DNase I的治疗潜力受到药代动力学的限制——半衰期短、酶稳定性差以及肺部清除速度快，这阻碍了其在炎症部位的持续活性。纳米技术的最新进展为这一问题提供了潜在的解决方案。可吸入的纳米载体可以增强药物滞留、防止酶降解，并改善肺部靶向性[19]、[20]、[21]。Lee等人开发了长效DNase I纳米颗粒，在败血症和COVID-19模型中显示出降低cf-DNA和中性粒细胞胞外陷阱（NETs）的治疗效果[21]、[22]。此外，涂有DNase I的纳米颗粒通过清除cf-DNA显著减少了小鼠的肺转移[23]。
然而，ALI不仅涉及炎症失调，还涉及氧化还原失衡，表现为活性氧（ROS）过多。无论是阳离子聚合物清除剂还是传统的DNase制剂，都无法有效应对炎症肺部的氧化应激。BR是一种从血红素代谢中提取的天然抗氧化剂，具有清除ROS和抗炎双重特性，其自组装性质使其适用于纳米医学应用[24]、[25]、[26]、[27]、[28]、[29]、[30]、[31]。此外，最近的研究表明，基于BR的纳米颗粒在肺部疾病中显示出有希望的治疗潜力。Jon报告称，BR纳米颗粒能有效减轻肺组织的炎症和氧化应激，这进一步支持了在肺部靶向治疗中使用BR纳米颗粒的合理性[28]、[29]。此外，BR本身具有内在的抗炎活性，为治疗炎症相关疾病提供了额外的优势[30]、[31]、[32]、[33]。
基于这些发现，我们试图构建一种基于BR的氧化还原响应型DNase I纳米平台，同时针对cf-DNA和ROS。在本研究中，我们用PEG-MAL对BR进行化学修饰，得到BR-PEG-MAL，该纳米颗粒（约160纳米）适合肺部给药。通过马来酰亚胺-硫醇偶联将DNase I结合到BR-PEG-MAL上，形成一种对ROS有响应的纳米结构，其中BR成分可以缓冲氧化应激并帮助保持DNase I的活性（图1A）。重要的是，我们的设计旨在使DNase I主要在细胞外环境中发挥作用，以降解cf-DNA，而不是依赖细胞内摄取作为主要作用部位。我们验证了BRn@DNase I中的cf-DNA降解活性和功能稳定性（活性保留），并在巨噬细胞模型和LPS诱导的ALI小鼠模型中证明了其治疗效果。BRn@DNase I不仅通过清除cf-DNA减轻了炎症，还调节了巨噬细胞的极化，从而提供了一种有前景的纳米治疗策略，用于通过肺部给药治疗ALI（图1B）。
材料
胆红素（BR）、N-(3-二甲氨基丙基)-N′-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC）、N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）和溴化乙锭（EtBr）购自Macklin Biochemical Co., Ltd.（中国上海）。NH?-PEG-MAL（分子量：2000）购自ShangHai ToYongBio Tech.Inc。香豆素6（C6）和甲基噻唑基四唑ium（MTT）购自Aladdin Biochemical Co., Ltd.（中国上海）。DNA Na（鲑鱼精子）购自上海元业生物科技有限公司（上海）。
BRn@DNase I的制备与表征
我们首先通过BR上的羧基与NH?-PEG-MAL上的胺基之间的酰胺缩合反应合成了BR-PEG-MAL。FTIR光谱（图S1A）证实了BR-PEG-MAL的成功形成，显示出羰基（1700–1750 cm?1）、酰胺C-N键（1020–1360 cm?1）以及PEG相关的C-H和醚键在约2900 cm?1和1100 cm?1处的特征峰。1600–1680 cm?1处的独特信号进一步表明了马来酰亚胺C=C键的存在。
讨论
ALI是一种进展迅速且危及生命的呼吸系统综合征，其特征是严重的低氧血症、肺泡损伤和全身性炎症[64]。全球每年有超过300万人受到ALI的影响，发病率和死亡率都很高[65]。ALI的发病机制复杂且多因素，涉及免疫反应失调和炎症介质的过度释放。在肺部受到创伤、烧伤或感染等损伤后，上皮细胞和内皮细胞...
结论
在这项研究中，我们开发了一种纳米形式的DNase平台BRn@DNase I，用于通过靶向清除cf-DNA来治疗ALI。该纳米复合物表现出良好的酶活性、结构稳定性和生物相容性。体外实验表明，BRn@DNase I有效抑制了巨噬细胞中由cf-DNA引发的TLR9–MyD88–NF-κB信号通路的激活，从而发挥了强大的抗炎作用。体内实验中，气雾剂输送的BRn@DNase I有效降低了cf-DNA水平...
CRediT作者贡献声明
陈瑞杰：撰写 – 审稿与编辑、项目管理、实验设计、概念化。徐一天合：撰写 – 原稿撰写、资源提供、方法学设计、实验实施。叶展正：软件使用、资源提供、方法学设计。朱奕轩：结果验证、软件使用、资源提供、方法学设计。张梦雪：结果验证、软件使用、资源提供、方法学设计。吕芳芳：数据可视化、结果验证、软件使用。王云志：数据可视化、结果验证、数据分析。狄新宇：数据可视化、结果验证
致谢
本研究得到了浙江省自然科学基金（LY24H010003）和温州市科学技术局（ZY2022013）的支持。我们感谢温州医科大学科研中心的咨询和仪器支持。同时，也感谢Figdraw平台提供的插图支持。
