《Journal of Drug Delivery Science and Technology》：Extrusion-based 3D-Printable Amyloid Nanofibril-based Hydrogel: A Multifunctional System for Hemostasis and Localized Drug Delivery Applications
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本研究成功制备了一种基于牛血清白蛋白（BSA）自组装纳米纤维的3D打印水凝胶，并负载姜黄素以结合机械稳定性和生物活性。该水凝胶具有多孔结构、优异的流变学和3D打印性能，可增强抗氧化活性并实现姜黄素的缓释。体外细胞毒性实验证实其生物相容性，同时表现出显著的止血效果。该材料为生物可降解支架和药物递送系统提供了新思路。
作者列表：Gouripriya D A、Prama Adhya、Arup Paul、Jaideep Adhikari、Pratik Das、Agnibin Kundu、Aditya Dev Rajora、Piyali Basak、Sabu Thomas、Prosenjit Saha、Pooja Ghosh
机构：印度西孟加拉邦Howrah市Santragachi区的JIS高等研究与学院（JISIASR）跨学科科学中心、JIS医学科学与研究学院，地址：51 South Nayabaz, GIP Colony
摘要
近年来，基于淀粉样纳米结构的水凝胶在生物医学研究中受到关注，因为它们具有优异的机械稳定性、生物降解性和生物相容性。本文提出了一种新型的可3D打印的淀粉样纳米结构水凝胶，该水凝胶将姜黄素封装在来自牛血清白蛋白（BSA）的纤维聚集体中，旨在结合纤维结构的固有机械稳定性和姜黄素的生物活性。所得到的复合水凝胶具有多孔结构、良好的流变特性以及优异的注射性和3D打印性能。根据ABTS（2,2′-偶氮-双（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）和2,2-二苯基-1-吡啶基肼（DPPH）自由基清除测试的结果，姜黄素显著增强了水凝胶的抗氧化活性。此外，体外药物释放测试表明，姜黄素通过膨胀或扩散实现了持续释放，证明了基于淀粉样蛋白的水凝胶作为姜黄素药物载体的有效性。通过体外细胞毒性实验评估了水凝胶的生物相容性和细胞毒性，结果显示其对L929小鼠成纤维细胞无毒性作用，支持了该水凝胶在细胞应用中的初步适用性。此外，这种水凝胶还具有强大的止血能力，可促进血液快速凝固。基于淀粉样纳米结构的水凝胶成为止血和局部治疗递送的有希望的候选材料。
引言
基于淀粉样纳米结构的生物材料近年来因其自组装特性、高机械强度以及在多种基质中的稳定性而受到广泛关注[1,2]。淀粉样纳米纤维（AF）是不溶性蛋白质聚集体，其特征是β片层结构，由可溶性蛋白质错误折叠和聚集形成[3,4]。这些聚集体是通过加热天然蛋白质溶液形成的，导致蛋白质纳米纤维错误折叠并自组装成三维网络。淀粉样纳米纤维聚集体的形成始于寡聚体的生长，随后延伸成更长的纤维，从而破坏正常细胞功能[5,6]，并导致阿尔茨海默病、帕金森病和2型糖尿病等疾病[7,8]。尽管这些淀粉样聚集体与多种致残性疾病相关，但由于其独特的结构特性以及良好的生物降解性和生物相容性[11,12]，如今它们被视为组织工程支架和药物递送载体的理想候选材料[9,10]。这些特性为制造新型功能性淀粉样基材料提供了可能性，包括支架[13,14]、纳米颗粒[15]、膜[16,17]和水凝胶[18,19]等。在各种基于淀粉样蛋白的材料中，基于淀粉样纳米结构的水凝胶最近因其在3D打印中的应用而受到科学界的广泛关注，可用于设计定制的三维支架用于生物医学应用[20,21]。水凝胶是三维网络，具有高保水能力、可调的物理性质和模拟细胞外基质的特性。此外，水凝胶可以与多种生物活性物质结合，以增强组织修复、药物递送和愈合效果[22,23]。淀粉样纳米纤维可以通过静电相互作用、氢键相互作用、π-π相互作用[24]和疏水相互作用[25]等物理作用轻松组装成水凝胶材料。这些水凝胶还表现出多种独特性质，如高保水性能[26]、高长宽比[27]、界面吸附[28]、良好的机械强度以及模拟细胞外基质（ECM）的特性[29,30]。此外，其触变和流变特性使其适合打印用途，并进一步应用于临床领域，特别是在伤口愈合和组织工程中[31]。此外，可3D打印的水凝胶可用作皮肤粘合剂[32]，其高吸水能力有助于保持伤口部位的湿润，从而促进伤口愈合[33]。鉴于基于淀粉样纳米纤维的水凝胶在临床研究中的重要性，研究人员开始致力于通过结合β-乳球蛋白（β-LG）与牛血清白蛋白（BSA）[34]、通过淀粉样纳米纤维和粘土纳米片的共组装制备纳米工程DNA水凝胶[35]、以及鸡蛋白白蛋白溶菌酶（HEWL）[36, 37, 38]等来制造新型水凝胶。然而，关于可3D打印的基于淀粉样蛋白的水凝胶的报道仍然有限。由于剪切作用能够使材料排列成预定结构[39, 40, 41]，可注射和可3D打印的肽水凝胶成为研究热点。考虑到肽水凝胶的特性及其与3D打印生物材料墨水的兼容性[42, 43]，我们当前的工作重点是使用BSA作为模型蛋白来设计可3D打印的基于淀粉样纳米结构的水凝胶。
姜黄素是一种疏水性化合物，其结构中含有酚基团和共轭双键。它具有广泛的生物活性，如抗癌、抗炎、抗菌和抗氧化作用[44, 45]，使其非常适合用于伤口愈合和组织工程应用[46, 47, 48]。此外，姜黄素具有出色的活性氧（ROS）清除活性，从而促进伤口部位的血管生成和胶原蛋白沉积。尽管姜黄素具有巨大的生物学潜力，但其主要缺点是水溶性差，这限制了其在临床中的应用，导致生物利用度低和不稳定[49, 50]。为了解决这些问题，研究人员致力于将姜黄素封装到各种纳米颗粒系统中，如自组装的纳米颗粒[51, 52, 53]、外泌体[54, 55, 56]、纳米囊泡[57, 58]、水凝胶[59, 60, 61]等。在众多基于淀粉样蛋白的材料中，基于淀粉样纳米结构的水凝胶因其高表面疏水性、优异的机械性能、高长宽比和高度有序的拓扑结构而受到特别关注[62]。
尽管近年来关于负载姜黄素的水凝胶系统的研究很多，但大多数研究集中在药物封装和释放特性上，很少有研究探索利用姜黄素修改水凝胶基质设计和加工性的可能性。据我们所知，目前还没有研究制备出既能3D打印又能同时利用姜黄素作为流变改性剂的基于淀粉样蛋白的姜黄素负载水凝胶。因此，在本研究中，我们合成了基于BSA的可3D打印的淀粉样纳米纤维水凝胶（方案1），并进一步将姜黄素纳入其中，以研究姜黄素负载BSA纤维水凝胶的治疗效果。这项工作介绍了一种完全由BSA和姜黄素制成的新型可3D打印水凝胶，无需外部交联剂或合成添加剂。水凝胶的结构完整性是通过自组装的淀粉样纤维实现的，而姜黄素则作为双重功能成分，同时提高了打印性和生物活性。与传统水凝胶不同，该系统通过避免使用有害化学物质简化了制备过程，提高了生物相容性。尽管姜黄素在淀粉样聚集过程中的作用已在分子水平上进行了研究，但由此产生的流变改性尚未在打印应用中得到充分利用。在我们的系统中，姜黄素不仅作为治疗成分，还作为BSA纤维网络的结构调节剂。通过调整姜黄素的加载百分比，可以轻松调节水凝胶的打印性能。此外，姜黄素在纤维内的溶解度和稳定性得到提高，有利于控制药物释放。鉴于3D生物打印在组织工程和生物医学应用中的重要性，我们认为当前的研究将为设计用于再生医学和治疗递送的新型可3D打印基于淀粉样纳米纤维的水凝胶铺平道路。
材料
牛血清白蛋白（BSA）、氯化钠、磷酸二氢钠、磷酸二钠、硫黄素T（ThT）、ABTS（2,2′-偶氮-双（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）和姜黄素均从印度Sisco Research Laboratories Pvt. Ltd.（SRL）购买，并按原样使用。细胞培养实验使用的L929小鼠成纤维细胞系来自印度Pune的NCCS。MTT（3-(4,5-二甲基噻唑-2-yl) 2,5-二苯基四唑溴化物）和二甲基亚砜（DMSO）也来自同一来源。
结果与讨论
在制备姜黄素封装的淀粉样纤维水凝胶之前，通过硫黄素T（ThT）荧光测定法确认了牛血清白蛋白（BSA）淀粉样纤维的形成。ThT是一种特异性染料，对淀粉样纤维具有弱荧光性，但在与淀粉样纤维结合时荧光强度显著增强。当在450 nm处激发时，ThT在482 nm处发出最大荧光峰，使其具有高度敏感性。
结论
简而言之，我们成功开发了一种可3D打印的基于淀粉样纳米纤维的水凝胶，该水凝胶封装了姜黄素，适用于潜在的药物递送和止血应用。这种水凝胶被认为对于通常难以融入水体系的疏水性药物（如姜黄素）的递送非常有效。来自BSA的淀粉样纳米纤维为水凝胶提供了机械稳定性，纤维与药物的相互作用促进了溶解度的提高。
未来展望
尽管该水凝胶表现出优异的细胞相容性、血液相容性、抗氧化活性和止血行为，但生物评估仅限于体外实验，需要在生理条件下进行体内伤口愈合和生物降解研究以验证其治疗效果和安全性。此外，尚未探索打印支架在动态生物环境中的长期机械稳定性和降解动力学。
作者贡献声明
Arup Paul：研究、数据分析。Jaideep Adhikari：写作、审稿与编辑。Pratik Das：写作、初稿撰写、研究。Agnibin Kundu：写作、初稿撰写、研究。Aditya Dev Rajora：写作、审稿与编辑。Piyali Basak：验证、监督。Sabu Thomas：验证、监督。Prosenjit Saha：写作、审稿与编辑、验证、监督。Pooja Ghosh：写作、审稿与编辑、初稿撰写、验证、监督。数据可用性
本研究生成和分析的所有数据均包含在主手稿中。
利益冲突声明
作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文报告的工作。
致谢
PG感谢西孟加拉邦政府WB-DSTBT（文件编号：STBT-11012(25)/12/2024-ST SEC提供的财政支持。PS感谢SERB-CRG（CRG/2021/005113）的资助。Gouripriya D A感谢印度科学技术部的DST-INSPIRE（IF220058）提供的奖学金。作者感谢MG大学Kottayam提供FTIR设施的支持。作者还要感谢Manish Kaushal教授的帮助。
