《Journal of Ethnopharmacology》：Shaoyao Gancao Decoction ameliorates rheumatoid arthritis via inhibition of TNF-α/NF-κB signaling pathway
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四逆散通过抑制TNF-α/NF-κB信号通路改善类风湿性关节炎症状，活性成分包括芍药苷、甘草酸等。
赵一颖|高凯瑞|赵一格|冯晨然|刘浩玲|史璐|孙文燕
北京中医药大学中药学院中药药理学系，北京102488，中国
摘要
民族药理学相关性
芍药（Paeonia lactiflora Pall.）和甘草（Glycyrrhiza uralensis Fisch.）的煎剂（SGD）源于东汉时期的《伤寒论》。作为一种传统处方，常用于治疗“痹”症，包括类风湿性关节炎（RA）、骨关节炎和强直性脊柱炎等疾病，SGD在缓解关节肿胀和疼痛方面表现出显著疗效。然而，其活性成分及其对抗RA的作用机制尚未完全阐明。
研究目的
研究SGD中的活性成分，并探讨其对抗RA的作用机制。
材料与方法
采用胶原诱导的关节炎（CIA）大鼠模型和MH7A细胞模型，在体内和体外研究SGD的治疗效果及其潜在作用机制。评估指标包括后爪肿胀、踝关节周长、关节炎指数（AI）评分、机械撤退阈值（MWT）、疼痛压力阈值（PPT）以及踝关节组织病理学变化。使用UHPLC-QE Plus-MS/MS分析SGD和滑膜组织的化学成分。处理SGD及其关键成分（芍药苷、甘草苷、甘草酸和甘草酸苷）后，测量大鼠血清和MH7A细胞中的TNF-α、IL-1β、IL-6和COX-2水平。通过Western blotting检测TNF-α、p-IKK、p-IκBα、NF-κB p-p65和COX-2的蛋白表达。通过分子对接和细胞热位移测定（CETSA）验证PLGGS成分与IKK、IκBα和NF-κB p65的结合情况，从而研究其对TNF-α/NF-κB信号通路的调节作用。这种综合方法用于系统阐明SGD的药理作用和潜在机制。
结果
通过UHPLC-QE Plus-MS/MS分析，我们鉴定了SGD配方颗粒中的59种不同化学成分。滑膜组织分析进一步确认了四种特定化合物：芍药苷、甘草苷、甘草酸和甘草酸苷。在CIA大鼠中，SGD可减轻后爪肿胀，降低AI评分和局部温度，增加MWT和PPT，减少胸腺和脾脏指数，并缓解踝关节病理损伤。SGD和PLGGS均显著抑制IL-1β诱导的MH7A细胞增殖，降低血清和细胞中的炎症因子（TNF-α、IL-1β、IL-6和COX-2）水平，并下调TNF-α、p-IKK、p-IκBα、NF-κB p-p65和COX-2的蛋白表达。分子对接和CETSA结果证实PLGGS成分与IKK、IκBα和NF-κB p65具有显著的结合亲和力。
结论
SGD通过抑制TNF-α/NF-κB通路发挥抗RA作用，其疗效归因于四种活性成分（芍药苷、甘草苷、甘草酸和甘草酸苷）对IKK、IκBα和NF-κB p65的调控作用。这些发现表明SGD是治疗RA的有希望的候选药物。然而，研究的局限性在于仅使用了单一批次的SGD。未来需要使用多批次样品来验证这些效果的重复性。
引言
类风湿性关节炎（RA）是一种自身免疫性疾病，主要表现为滑膜过度增生和炎症、血管翳形成以及软骨破坏[1]。流行病学调查显示，中国RA的发病率高达0.4%，患者数量约为500万，并且每年都在增加。RA具有病程长、病情持续加重的特点。未经标准化治疗，两年后的残疾率可高达50%[2]，这严重影响了患者的生活质量，给患者及其家庭带来巨大负担。
RA的病因和机制尚未完全明了，目前尚无根治方法。临床常用的西药包括非甾体抗炎药（NSAIDs）、改病情抗风湿药（DMARDs）、糖皮质激素（GCs）和生物制剂[3]。虽然这些药物能有效缓解症状并提高生活质量，但常伴有严重的甚至危险的副作用。因此，发现和开发有效的RA治疗方法具有重要的社会和经济意义。
在中医理论中，RA属于“痹”证[4]。中医认为RA通常由抗病能力不足、外卫不足或脏腑阴阳失衡引起内生病理因素，或由六淫（风、寒、湿、热、火、燥、瘀）侵袭导致[5]。中医积累了丰富的有效方剂用于治疗“痹”证。芍药（Paeonia lactiflora Pall.）和甘草（Glycyrrhiza uralensis Fisch.）的煎剂（SGD）是一种著名的止痛处方，最早由张仲景在东汉时期的《伤寒论》中记载，比例为1:1[6]。该方剂被列入2018年国家中医药管理局和国家药品监督管理局发布的《古代经典方剂目录（第一批）》。在日本，SGD被称为“Shakuyakukanzoto”[7]；在韩国则称为“Jakyak-Gamcho-Tang”[8]。此外，Paeonia lactiflora Pall.和Glycyrrhiza uralensis Fisch.在历史上也被用于其他医疗体系。在欧洲，Paeonia lactiflora Pall.也被用于止痛、抗感染和治疗高血压[9]。Glycyrrhiza uralensis Fisch.在阿育吠陀医学中因其抗炎、免疫调节和抗氧化作用而被广泛应用[10]。该草药在欧亚经济联盟成员国（包括俄罗斯、白俄罗斯和哈萨克斯坦）的药典中也有正式记载[11]。在欧洲传统医学中，它用于缓解呼吸系统和胃肠道不适[12]；欧洲药品管理局发布了关于Glycyrrhiza glabra L.、Glycyrrhiza inflata Bat.和/或Glycyrrhiza uralensis Fisch.根和根茎的草药专论[13]。在该方剂中，白芍（Radix Paeoniae Alba）味酸寒，具有养血、滋阴、柔肝止痛的作用；甘草（Radix Glycyrrizae）味甘温，具有健脾、益气和止痛的作用。两者结合使用具有协同效应：酸味起到抑制作用，甘味起到缓解作用，共同滋养阴血、柔肝止痛。该方剂主要用于因阴血不足和筋脉燥涩引起的疼痛以及肌肉痉挛。
临床研究证实了SGD在治疗RA方面的有效性[14]、[15]、[16]。实验研究表明，SGD具有抗炎、镇痛和免疫调节作用。其抗炎作用归因于对NF-κB信号通路的调节以及炎症介质（如TNF-α）水平的降低。此外，Radix Paeoniae Alba和Radix Glycyrrizae以1:1的比例组合具有最佳镇痛效果[17]、[18]。Radix Paeoniae Alba、Radix Glycyrrizae及其活性成分也显示出抗炎、镇痛和免疫调节作用[19]、[20]、[21]。然而，关于SGD在RA治疗中的药效学研究尚不系统，其作用机制仍不明确。因此，需要进一步探索和研究。我们之前的网络药理学分析表明，干预TNF-α/NF-κB信号通路可能是SGD治疗RA的机制之一[22]，但这一假设需要进一步的实验验证。
基于这一假设，我们使用胶原诱导的关节炎（CIA）大鼠模型和培养的人类类风湿性关节炎成纤维细胞样滑膜细胞（MH7A）在体外观察SGD的治疗效果，并通过TNF-α/NF-κB信号通路探讨其作用机制，以提供进一步应用的实验依据。
化学成分与试剂
使用了Tripterygium glycosides片剂（2105113B，浙江Deend Pharmaceutical Co., Ltd.，中国）、MH7A细胞系（广州Ginio Biotechnology Co., Ltd.，中国）、甲氨蝶呤（A6770，Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易斯）、Fluke TiS50红外热成像仪（TiS50，Fluke，美国）、RIPA裂解缓冲液（P0013C，Beyotime，上海，中国）和IKK ELISA试剂盒（YJ063716，Yuanju Bio，上海，中国）。同时购买了BCA蛋白测定试剂盒（ZJ101）和超灵敏ECL化学发光试剂盒（P10100）。
SGD的化学组成
为鉴定SGD（配方颗粒）中的成分并进行质量控制，使用UHPLC-QE Plus-MS/MS技术分析了SGD中的成分。根据保留时间、相对分子质量、多级质谱碎片信息和文献报道，共鉴定出59种化合物，包括43种黄酮类、6种单萜及其皂苷、3种三萜及其皂苷、6种酚类化合物和1种香豆素化合物。
讨论
SGD作为首批被收录在《古代经典方剂目录》中的复方处方，源自张仲景的《伤寒论》。该处方简洁有效，受到历代医生的高度评价，在古今中医学临床实践中广泛应用。现代药理学和临床研究也证实了SGD的疗效
结论
这项结合化学分析和体内、体外模型的综合研究为SGD在RA治疗中的应用提供了有力证据。其治疗效果主要通过抑制TNF-α/NF-κB信号通路实现，其中芍药苷、甘草苷、甘草酸和甘草酸苷被确定为靶向IKK、IκBα和NF-κB p65的关键活性成分。总之，本研究明确了SGD的物质基础和分子机制。
作者贡献声明
刘浩玲：数据可视化、方法学设计。史璐：数据验证、调查、数据管理。赵一颖：初稿撰写、数据可视化、方法学设计、调查。高凯瑞：修订与编辑、数据可视化、验证、监督、调查。赵一格：数据验证、调查、数据管理。冯晨然：数据验证、调查、数据管理。孙文燕：撰写、修订与编辑、项目管理、资金申请。数据可用性声明
研究中呈现的原始数据包含在文章/补充材料中，如有进一步疑问，请联系相应作者。
利益冲突
作者声明本研究未涉及任何可能构成利益冲突的商业或财务关系。
资助
本研究得到了北京中医药大学的研发基金的支持（2020-ZXFZJJ-022）。
利益冲突声明
作者声明不存在可能影响本文研究的已知利益冲突或个人关系。
