通过PI3K/Akt信号通路研究RHEI FLOS提取物对抗肝癌的机制作用：体外与体内实验

《Journal of Ethnopharmacology》：Mechanistic Investigation of RHEI FLOS extract Against Hepatocarcinoma via the PI3K/Akt Signaling Pathway In Vitro and In Vivo

掌叶大黄花粉提取物通过抑制PI3K/Akt信号通路及上调凋亡相关基因，在体外和体内实验中表现出显著的抗肝细胞癌活性。

　　

强玉静|马嘉荣|赵敏|李莉|王玉辉|李云

甘肃中医药大学药学院，兰州，730101，中国

摘要

民族药理学相关性

现代药理学研究表明，Rheum palmatum L. 及其制剂具有抗肝细胞癌（HCC）的作用。据报道，花青素也具有抗HCC活性。然而，Rhei Flos（RF）来源的花青素在HCC治疗中的具体作用及其机制尚未得到探索。研究这些机制可能为RF的肝脏保护特性提供新的见解，并证实其在HCC治疗中的潜在应用。

研究目的

我们研究了RF提取物在HepG2人肝癌细胞和H22肿瘤小鼠中的抗肝癌机制是否通过PI3K/Akt信号通路介导。

材料与方法

通过细胞功能实验，研究了RF提取物对HepG2细胞的增殖、侵袭、迁移和凋亡的影响。Western blotting用于分析RF提取物处理后PI3K/Akt信号通路中关键蛋白和基因的表达。生化指标、器官指数、肿瘤抑制率、组织病理学分析、免疫荧光和Western blotting用于评估RF对H22肿瘤小鼠的治疗效果。

结果

RF提取物显著抑制了HepG2细胞的活力和迁移，同时促进了凋亡（P < 0.05或P < 0.01）。RF提取物处理显著降低了Ki67和NF-κB的表达，以及p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt比值和p-mTOR/mTOR的表达，但增加了PTEN、TNF-α、Bax、Caspase-8、Caspase-9和Caspase-3的表达（P < 0.05或P < 0.01）。

结论

RF提取物通过调节肿瘤相关生长因子、增强细胞免疫和上调肿瘤抑制基因PTEN的表达来发挥抗肝癌作用。RF提取物还抑制了PI3K、p-Akt、p-mTOR、NF-κB和Bcl-2在PI3K/Akt通路中的表达，从而促进下游Bax、caspase-9和caspase-3的表达，最终诱导肿瘤细胞凋亡。

引言

原发性肝癌包括三种病理亚型：肝细胞癌（HCC）、肝内胆管癌（ICC）和混合型肝细胞癌和胆管癌（cHCC-CCA）。HCC的主要原因是乙型肝炎病毒（HBV）和/或丙型肝炎病毒（HCV）感染、慢性酒精消费（酒精性肝病）、非酒精性脂肪性肝炎、黄曲霉素污染的食物和血吸虫病，这些因素都会导致肝脏微环境的改变，进而推动肝细胞恶性转化和肝硬化。最近的研究还表明，衰老、糖尿病、肥胖、吸烟和药物引起的肝损伤也是HCC的额外风险因素（Bray等人，2018年；欧洲肝脏研究协会，2018年；Zhang等人，2004年）。根据GLOBOCAN的数据，2022年全球约有86万例新发肝癌病例，位列所有恶性肿瘤第六位，导致76万人死亡，成为癌症相关死亡的第三大原因（Bray等人，2024年）。另一项研究显示，中国的肝癌发病率、死亡率（2020年）和标准化伤残调整寿命年（DALY）率（2019年）高于美国和英国（Qiu等人，2021年）。肝癌是中国第四大常见恶性肿瘤和第二大癌症相关死亡原因，对公共卫生构成重大威胁（Chen等人，2016年；Xia等人，2022年；Zhou等人，2019年）。

肝癌手术后的五年复发率约为70%（Roayaie等人，2013年）。分子靶向疗法、全身化疗、放疗、免疫疗法和联合疗法常常对肝脏、肾脏、胃肠道和造血系统造成严重不良反应，导致患者依从性差和长期疗效降低（Zhu等人，2017年）。中医在肿瘤抑制、减少毒性、延缓复发和转移、缓解症状、改善生活质量以及延长肝癌患者生存期方面显示出益处。中医在中国肝癌治疗中逐渐被认可为关键策略。从天然产物（包括中药）中寻找具有抗癌效果的生物活性化合物已成为药物开发的主要焦点（Li等人，2022年）。扩展传统抗肝癌草药的药物成分和作用机制具有重要的治疗潜力。

Rheum palmatum L（中国大黄）属于蓼科植物，其干燥的根和根茎传统上被用于泻下、清热、凉血、解毒、消瘀和退黄疸等功效，这在中国药典中有记载（Guo等人，2022年；Park等人，2020年）。中药方剂大黄浙虫丸能够抑制裸鼠体内多柔比星（DOX）耐药性肝细胞癌异种移植瘤的生长，并增加DOX诱导的凋亡，从而逆转DOX耐药性并增强其抗肿瘤效果（Wu等人，2017年，2018年）。三黄汤通过PI3K信号通路抑制他莫昔芬耐药性MCF-7细胞的增殖、迁移和侵袭（Chen，2019年）。Kim的研究表明，大黄素通过抑制蛋白激酶B（Akt）信号通路发挥抗癌作用（Kim等人，2018年），延长癌细胞的G1期并加速其凋亡。传统中药文献记载了使用花提取物治疗肝病的应用，文献还指出花青素具有一定的抗癌特性（Lin等人，2017年；Yue等人，2019年）。此外，富含花青素的黑树莓提取物通过抑制PI3K/Akt通路对JB6小鼠表皮细胞发挥抗肿瘤作用，导致VEGF下调（Huang等人，2006年）。另外，Lycium ruthenicum中的花青素通过激活PTEN和PTEN/PI3K/Akt/Caspase-3信号通路抑制DU-145前列腺癌细胞的增殖并诱导凋亡（Li等人，2021年）。由于R. palmatum提取物及其制剂具有抗癌效果，且花青素显示出肝脏保护潜力，我们假设RF提取物可能具有抗肝细胞癌的特性。本研究不仅最大化了每年收获的茎部的利用价值，还为扩展R. palmatum的药用部位及其工业应用提供了理论基础。PI3K/Akt通路是细胞增殖和凋亡的关键调节因子。研究表明，内在和外在的凋亡途径都参与了肿瘤细胞的凋亡。过量的活性氧（ROS）会激活抗氧化途径，并与PI3K/Akt通路的过度激活相关。花青素的多酚羟基结构使其能够调节自由基的水平，从而通过抑制PI3K/Akt通路发挥抗癌活性。RF含有1.50–1.90%的总花青素，其提取率为5.32%。在欧洲，花青素浓度超过24%的提取物被归类为药用物质。市售提取物通常含有24%的花青素。意大利和德国已将Vaccinium myrtillus L.（越橘）的粗花青素提取物纳入药典（Hu等人，2006年）。此外，欧洲国家已经开发出纯化花青素至浓度超过36%的专有技术。提高RF花青素的纯度将有助于未来研究的质量控制，并允许在体外和体内探究RF提取物的抗肝细胞癌效果。研究流程图见图1。

材料与试剂

使用了D101树脂（上海Macklin生化有限公司，20230323）、AB-8树脂（北京Solarbio科技有限公司，417G011）和XAD-7HP吸附树脂（北京Solarbio科技有限公司，CAS，37380-43-1）。氰苷-3-O-葡萄糖苷从兰州志普瑞生物科技有限公司购买（ZC220619），顺铂从齐鲁制药有限公司购买（批号：3D0214B03）。抑制剂LY294002（CAS号：154447-36-6）也由该公司提供

RF提取物中花青素的分离与定量分析

使用紫外分光光度计对标准化合物氰苷-3-O-葡萄糖苷进行线性回归分析，得到方程Y = 55.222X + 0.0026（r = 0.9999）。该化合物的线性范围为0.001–0.016 mg/mL（图2A）。当使用50%酸化乙醇（盐酸溶液，pH 3.5）时，提取效果最佳（图2B）。基于吸附和脱附效率，选择了XAD-7HP树脂（图2C）。对于静态吸附，最佳样品

讨论

基于文献综述，选择HepG2细胞作为体外抗HCC活性的研究模型。文献还指出，HCC的发展与细胞增殖的失控调节和凋亡机制的失活密切相关（Babichev等人，2016年；Cho，2014年；Riquelme等人，2016年）。基于体外抗HCC活性实验，进行了体内抗HCC活性研究。

结论

本研究表明，RF提取物通过协同的多靶点作用发挥抗肝癌效果。体外实验中，RF提取物抑制了细胞活力，抑制了细胞侵袭和迁移。RF提取物还调节了PTEN/PI3K/Akt信号通路，最终通过线粒体途径诱导肿瘤细胞凋亡。体内实验中，RF提取物调节了免疫功能，重塑了免疫微环境，降低了肿瘤生长相关因子的表达

作者贡献声明

强玉静：撰写——初稿，数据管理。马嘉荣：撰写——初稿。李莉：数据管理。赵敏：软件操作，数据管理。李云：撰写——审稿与编辑，验证，方法学研究，资金获取。王玉辉：撰写——初稿

未引用参考文献

欧洲肝脏研究协会，2018年。

利益冲突

研究人员声明在本研究中不存在任何利益冲突。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能会影响本文工作的竞争性财务利益或个人关系。

数据可用性

数据可应要求提供。

资金来源

“利用大黄茎开发纯天然抗炎和抗菌植物牙膏”——2021年第五批关键研发项目（30440440）。

利益冲突声明

? 作者声明他们没有已知的可能会影响本文工作的竞争性财务利益或个人关系。

致谢

“利用废弃大黄茎开发纯天然抗炎和抗菌植物牙膏”——2021年第五批关键研发项目（30440440）。