《Journal of Genetics and Genomics》：A single-nucleus and spatial transcriptomic atlas of poplar leaves reveals the regulation of leaf polarity and cuticle deposition
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植物叶片腹背极性形成机制及MYC2调控蜡质合成的分子网络研究。通过单细胞测序和空间转录组学技术，解析了不同极性细胞在代谢途径（苯丙烷类/黄酮类）和胁迫响应通路上的差异，发现MYC2通过调控脂质合成基因（CER10、LTPG1等）促进腹面表皮蜡质增厚，揭示代谢梯度与转录因子网络协同调控极性的分子机制，为作物抗逆性改良提供理论依据。
李一玲|孔凌飞|郭星|陈阳|邵文文|刘敏|罗晨梦|梁少明|冯敖|徐莉|刘欢|魏通|蒋元中|马涛
教育部生物资源与生态环境重点实验室，四川大学生命科学学院四川卓戈高山湿地生态系统国家观测研究站山地植物离体保存与资源利用实验室，中国成都610065
摘要
叶片的腹面-背面极性对于植物形态发生和环境适应至关重要，这通过不对称的细胞分化实现。新的证据表明，背腹方向的代谢梯度在转录网络之后起作用，以微调细胞特化。虽然保守的转录因子（如HD-ZIP III、KANADI）建立了初始的极性，但驱动位置特异性细胞分化的分子网络及其与代谢适应的整合仍不清楚。利用单核和空间转录组学技术，我们鉴定了主要的细胞类型（叶肉、表皮和与维管组织相关的细胞）及其腹面-背面亚型，揭示了转录谱型和代谢途径中的背腹极性。腹面细胞富含苯丙素/黄酮类物质的生物合成，而背面细胞则表现出对胁迫和激素信号的反应更为活跃。值得注意的是，我们发现MYC2是调控腹面角质层生物合成的关键因子，它能够结合脂质生物合成和转运基因（如CER10、LTPG1）的启动子，并促进角质层增厚。我们的研究揭示了位置身份如何塑造叶片的转录和代谢极性，其中MYC2作为协调器官特异性适应的核心调节因子。这些发现为植物发育和胁迫抗性的空间调控提供了见解，为培育耐胁迫的木本作物提供了潜在策略。
引言
叶片腹面-背面极性的建立是植物形态发生的基本过程，它不仅决定了叶片的扁平结构，还通过不对称的细胞分化影响光合作用效率和环境适应（Bowman等人，2002年）。经典研究确定了调控背腹模式的保守转录因子（TFs）：HD-ZIP III家族成员决定了腹面特征，而KANADI和YABBY TFs则赋予背面特征（Emery等人，2003年；Eshed等人，2004年）。然而，这些机制主要负责初始极性的建立；驱动位置特异性细胞分化的分子网络及其与环境适应的整合仍不甚明了。最近的证据表明，发育代谢网络动态调节细胞腹面-背面的命运决定和叶片表型的可塑性，以响应生长和环境信号，从而适应外部胁迫。这一点得到了YABBY参与大豆非生物胁迫响应（如盐胁迫、干旱和脱落酸（ABA）（Wang等人，2024年）以及青蒿素生物合成调控（Kayani等人，2021年）的支持。此外，代谢途径也表现出背腹极性：在拟南芥的栅栏组织细胞中，苯丙素途径基因表现出腹面优先表达，通过响应光照梯度来减轻光氧化损伤（Procko等人，2022年），而二羟基黄酮类物质在叶片表皮中呈现不对称分布（Agati等人，2013年）。总体而言，这些观察表明沿着背腹轴存在一个保守的代谢梯度，该梯度在转录因子网络之后起作用，区域性地协调细胞代谢。这种基于梯度的机制与动物胚胎中的形态发生梯度类似（Choe等人，2015年），但在植物中尚未得到系统研究。
腹面表皮通常具有更厚的角质层、更低的气孔密度和更高的叶绿体含量。相比之下，背面表面具有更薄的角质层、显著更高的气孔密度和更复杂的毛状体分布。叶片角质层主要由角质质和蜡组成（Domínguez等人，2011年），是植物与其外部环境之间的主要屏障。角质质单体主要由C16-C18长链脂肪酸合成，而蜡成分主要来源于非常长链脂肪酸（VLCFA）衍生物（≥20个碳原子），包括烷烃、烯烃、醇、酮、醛和酯（Kunst和Samuels，2003年）。正向和反向遗传学方法系统地鉴定了参与角质层形成的关键基因，包括编码生物合成酶（如长链酰基-CoA合成酶（LACSs）、3-酮酰基-CoA合成酶（KCS）、3-酮酰基-CoA还原酶（KCR）、羟基酰基-CoA脱水酶（HCD）和烯酰基-CoA还原酶（ECR））以及转运蛋白（如ATP结合盒（ABC）转运蛋白11（ABCG11）、ABCG32和GLYCOSYLPHOSPHATIDYLINOSITOL-ANCHORED LIPID PROTEIN TRANSFER（LTPG）（Bird等人，2007年；Lee等人，2009年；Weng等人，2010年；Javelle等人，2011年；Fabre等人，2016年；Fukuda等人，2022年）。角质层蜡的生物合成受到多层次基因调控网络的调控，整合了多种环境信号。关键的中介转录因子包括APETALA2/ETHYLENE RESPONSIVE FACTOR（AP2-EREBP）类型（如SHN1）、MYB家族成员（如MYB16、MYB30、MYB96和MYB106）以及锌指蛋白（如NFXL2）（Aharoni等人，2004年；Seo等人，2011年；Lisso等人，2012年；Oshima等人，2013年；Zhang等人，2019年；Yang等人，2022年）。角质层对植物胁迫响应至关重要；尽管诱导角质层生物合成基因的表达可以增强胁迫适应（Wang等人，2011年；Cui等人，2016年；Song等人，2022年），但代谢通量的改变可能会带来发育上的权衡（He等人，2022年）。此外，角质层特性影响表皮细胞的分化。在环境胁迫下，空间上的角质层异质性会产生适应性特征，例如干旱会触发腹面角质层增厚和背面密度降低，以优化水分保持（Li等人，2007年；Lewandowska等人，2020年）。
茉莉酸（JA）信号通路通过与植物激素网络的协同/拮抗作用来协调胁迫响应和发育过程（Abe等人，2003年；Li等人，2004年；Wasternack，2007年；Wang等人，2023年）。这种调控能力也扩展到角质层形成，例如棉花中的TF GhWIN2：它在转录上激活与角质层相关的基因，同时刺激JA的生物合成并抑制水杨酸（SA）的产生（Li等人，2019年）。在拟南芥叶片中，JA信号通路在响应损伤时正向调节蜡和角质质单体的生物合成（Huang等人，2024年）。从机制上看，JA和VLCFA的生物合成通过共同的氧脂素前体12-氧代植二烯酸（OPDA）汇聚，这是蜡生物合成的基本底物。这些发现表明JA通路可能对角质层蜡和角质质的生物合成产生影响。
传统的植物器官极性研究依赖于突变体表型分析或in situ杂交，缺乏对异质细胞群体中动态调控的单细胞分辨率。最近的空间转录组学突破（如Visium、Stereo-seq）现在能够进行器官发育的拓扑分析（Martinez等人，2021年；Xia、Keke等人，2022年；Liu等人，2023年）。在这项研究中，我们通过整合单核测序（snRNA-seq）和空间转录组学（Stereo-seq）系统地解析了Populus alba var. pyramidalis叶片腹面-背面细胞的功能分化和调控网络，重建了一个具有空间分辨率的细胞类型图谱。分析显示，背面细胞与腹面细胞在次级代谢（苯丙素/黄酮类物质生物合成）和胁迫响应途径上的表达谱型存在差异，鉴定出MYC2转录因子是腹面细胞中的核心转录调节因子。通过结合CUT&Tag-seq、转录组学和遗传学方法，我们证明JA信号成分MYC2通过激活蜡和角质质的生物合成及转运基因来调节背腹方向的角质层异质性。我们的工作提供了一个多维框架，揭示了植物器官极性的时空动态，并确立了JA信号作为角质层蜡和角质质沉积的直接因果调节因子，尤其是在木本植物中。
部分摘录
杨树叶片的单核和空间转录组分析
为了在单细胞分辨率下研究杨树叶片的基因表达，我们使用两个月大的P. alba var. pyramidalis幼苗的叶片进行了snRNA-seq和高分辨率Stereo-seq（图1A、S1、S2）。对于snRNA-seq，我们从叶片中分离出细胞核，并使用DNBelab C4滴液平台制备文库。经过严格的质量控制后，我们从两个生物学重复样本中获得了14624个和9144个细胞核的转录组，中位独特分子标识符
讨论
在这项研究中，我们将snRNA-seq与高分辨率Stereo-seq相结合，全面绘制了P. alba var. pyramidalis叶片的细胞类型和空间结构。这两种方法具有互补性。具体来说，稀有细胞簇（如C16和C17），这些细胞富含细胞周期基因，可能代表增殖细胞，主要被Stereo-seq捕获。这种差异可能是由于有丝分裂细胞的核脆弱性增加所致
植物生长条件和组织收集
Stereo-seq和snRNA-seq是在P. alba var. pyramidalis上进行的。植物转化使用了三倍体中国白杨（P.0× tomentosa）。转基因、突变体和野生型植物在受控温室条件下生长（25°C和16小时光照/8小时黑暗周期）。两个月大的植物被用于组织学分析、扫描电子显微镜（SEM）和气相色谱-质谱（GC-MS）。GFP-FLAG标记的转基因植物被用于CUT&Tag实验。
snRNA-seq文库制备和测序
收集了两个月大的
P. alba var.
pyramidalis的新鲜叶片
CRediT作者贡献声明
李一玲：方法学、研究、数据管理、初稿撰写、审稿与编辑。孔凌飞：资源提供、方法学、正式分析。郭星：方法学。陈阳：数据管理。邵文文：方法学。刘敏：样本处理。罗晨梦、梁少明、冯敖、徐莉：数据管理、方法学、验证。刘欢和魏通：样本处理、方法学。蒋元中和马涛：资金获取、项目管理、监督致谢
我们感谢西南大学的L.-F.K.提供了myc2双突变体和MYC2b-OE品系。我们感谢中国农业部基因组学重点实验室（深圳，518120）和广东省农作物遗传资源研究与应用重点实验室（深圳，518120）提供的数据测序支持。本工作得到了国家重点研发计划（2021YFD2201100）和国家自然科学基金的支持
