无需提取的快速LAMP-CRISPR/Cas12a检测方法，用于检测伪狂犬病病毒

《Journal of Virological Methods》：Extraction-free, rapid LAMP-CRISPR/Cas12a assay for detection of pseudorabies virus

猪伪狂犬病毒检测及LAMP-CRISPR/Cas12a快速诊断系统的开发，实现高灵敏度（1.0×10?? copies/μL）和特异性，无需核酸提取，设备要求低，结果1小时内肉眼可见，适用于猪场现场诊断和流行病学监测。

　　

李聪聪|张乐乐|徐秋亮

河南农业大学动物科学与技术学院，中国河南省郑州市

摘要

本研究开发了一种LAMP-CRISPR/Cas12a检测系统，用于快速可视化地识别猪伪狂犬病病毒（PRV）。基于病毒致病基因gG的保守序列，设计了最优的sgRNA和LAMP特异性引物。该联合检测系统显示出比PCR-CRISPR/Cas12a和qPCR方法更优越的敏感性，目标质粒DNA的检测限达到1.0×10??拷贝/μL。特异性测试确认了该方法能够选择性地识别PRV，而不会与其他猪病原体发生交叉反应。将26份血清样本在LAMP-CRISPR/Cas12a和PCR-CRISPR/Cas12a系统之间进行平行比较，结果显示阳性结果的一致性为100%，两种方法均检测出了12份阳性样本。该方法无需提取病毒核酸，仅需要恒温设备和/或基本的荧光检测设备。结果可在一小时内获得，并且肉眼可见。这种简单、灵敏且不依赖设备的方法非常适合现场快速诊断猪的伪狂犬病，在临床诊断、流行病学监测和现场检测中具有重要的应用价值。

引言

病毒性感染（如COVID-19对人类健康的影响以及非洲猪瘟对养猪业的影响）造成的严重损害，凸显了应对病毒性疾病这一关键挑战的持续必要性。伪狂犬病病毒（PRV）于1902年首次在匈牙利被发现，此后作为重要病原体给全球养猪业带来了巨大损失（Xia等人，2018年）。PRV是一种有包膜的双链线性DNA病毒，属于疱疹病毒科的Alphaherpesvirinae亚科。PRV具有广泛的宿主范围，包括多种哺乳动物。最近的研究表明，人类也可能成为这种病原体的潜在宿主（Liu等人，2021年）。然而，猪是其唯一的自然宿主和储存宿主（Freuling、Muller和Mettenleiter，2017年）。由于PRV的致病性和破坏性，它对猪的神经系统、生殖系统和生长系统构成严重威胁。感染PRV的新生仔猪可能出现共济失调、瘫痪和致命衰竭等症状，15天以下的仔猪死亡率可高达100%。在怀孕母猪中，感染会导致胎盘侵入胎儿，引发流产、死产和胎儿木乃伊化等生殖障碍。处于育肥阶段的猪在感染后会出现呼吸窘迫和生长缓慢的症状（Tan等人，2021年）。

尽管在一些发达国家通过疫苗接种和根除措施有效控制了PRV的爆发，但在中国等国家，PRV的流行仍然存在。对中国29个省收集的25万份猪血清样本的分析表明，猪群中PRV感染的流行率仍然很高，平均血清阳性率为29.87%，某些地区甚至超过35%。PCR分析显示猪中PRV的核酸阳性率约为11.5%，表明该病毒仍在持续传播（Tan等人，2021年）。根据一项荟萃分析，2010年至2024年间中国猪群中PRV的总体流行率为21.5%。虽然整体感染水平呈下降趋势，但某些地区（尤其是北部地区）的感染率仍然相对较高（Gao、Zhang和Zhu，2025年）。在中国，疫苗接种是预防PRV的主要手段。自2011年以来，利用Bartha K61疫苗的中国许多养猪场出现了毒性增强和逃避疫苗能力的新型PRV变种，导致疫苗保护效果不足（Bo和Li，2022年；Yu等人，2014年）。病原体的检测和鉴定是疫苗开发的基础前提，是评估疫苗效果和监测疾病爆发的关键工具。因此，准确及时的PRV诊断至关重要。伪狂犬病病毒最初于1947年在中国被发现。在过去七十年中，政府和科学界为控制PRV做出了巨大努力，特别是通过加强养猪场的生物安全措施。然而，整体控制情况仍然严峻，这突显了进行流行病学调查、诊断技术和疫苗研究的持续必要性。

随着分子生物学的进步，已经开发了多种用于PRV检测的免疫学和核酸检测方法，包括ELISA、免疫层析、PCR、qPCR、LAMP、RPA、数字PCR等。传统的PRV诊断方法包括酶联免疫吸附测定（ELISA）（Serena等人，2013年；Serena等人，2011年；Silva-Junior等人，2020年）和免疫层析试纸（Guo等人，2015年；Li等人，2015年；Shen等人，2018年；Vrublevskaya等人，2017年）。这些方法通过检测抗体或抗原来快速筛查感染，适用于大规模的流行病学调查。ELISA因其高通量和优异的敏感性而被广泛用于抗体检测，特别是在评估疫苗诱导的免疫力方面发挥着关键作用。然而，传统的ELISA和免疫层析方法虽然操作简便，但在感染早期抗体尚未产生时敏感性较低，导致假阴性结果的可能性较高，且灵敏度和特异性有限。某些免疫学检测中的抗体交叉反应可能会降低检测的特异性。此外，较长的检测时间和较高的样本处理要求也限制了这些方法的应用。核酸检测方法可以扩增含有物种特异性信息（通常是致病基因）的病毒核酸，从而在几小时内识别病毒。核酸检测技术是PRV分子诊断的基石，具有高灵敏度和特异性，适用于早期检测和病毒基因分型。常用的技术包括传统PCR、多重PCR、qPCR、等温扩增和数字PCR。传统PCR（Harding等人，1997年；Jestin等人，1990年；Lokensgard等人，1991年）和多重PCR（Li等人，2019a；Zeng等人，2014年）常用于PRV检测，通过扩增特定基因片段来识别和分型病毒。这些方法操作简单、成本效益高，适用于常规实验室检测。尽管操作简便且成本效益高，但PCR需要相对较高的样本纯度，且灵敏度有限，容易受到实验室条件的影响，容易产生假阳性结果。此外，PCR需要昂贵的精密温度控制系统，不适合便携式使用，限制了其在现场检测中的应用。与传统PCR相比，实时定量PCR（qPCR）已成为PRV检测的金标准，能够实时监测扩增过程、量化病毒载量并提高灵敏度（Liu等人，2018年；Thiery等人，1996年；Tian等人，2020年；Zanella等人，2012年）。然而，其设备成本较高，对PCR抑制剂敏感，依赖标准曲线进行相对定量，需要操作者具备较高的技术水平，不适合快速现场检测。为了克服PCR技术的局限性，研究人员开发了等温扩增技术，如LAMP（En等人，2008年；Fang等人，2010年；Zhang等人，2010年）和RPA（Wang等人，2018年；Yang等人，2017年）。这些技术无需复杂仪器，具有高特异性和灵敏度，处理时间短，适合现场检测。不过，引物设计要求严格，也可能导致假阳性结果。数字PCR（dPCR）是一种用于绝对定量核酸分子的技术，通过分区扩增实现绝对定量，具有较高的灵敏度和准确性，适用于检测病毒载量较低的样本（Ren等人，2018年；Tian等人，2025年；Yu等人，2025年）。但由于成本高和操作复杂，其在常规检测中的广泛应用尚未实现。

CRISPR/Cas是一种存在于古菌和细菌中的适应性免疫系统，已被重新用于基因编辑，并广泛应用于遗传学研究和治疗应用。基于Cas12a/12b的旁路切割活性，开发了一种高灵敏度和特异性的DNA检测及快速可视化核酸检测系统（Chen等人，2018年；Li等人，2018年；Li等人，2019b年；Teng等人，2019年）。CRISPR-Cas12a/12b系统的灵敏度有限，通常需要结合PCR或等温扩增等技术来增强检测效果。在本研究中，我们结合了LAMP和CRISPR-Cas12a系统的优势，通过将LAMP的高灵敏度与CRISPR-Cas12a结合，提高了检测灵敏度。此外，Cas12a的二次检测有助于减少LAMP引起的假阳性结果。通过结合这两种方法，可以有效地实现PRV检测的高灵敏度和特异性。

部分内容摘录

病毒样本

PRV、PPV、PRRSV和PEDV的核酸分离株来自实验室库。使用Ezup Viral DNA提取试剂盒（Sangon Biotech，上海）提取DNA病毒的核酸，并在定量后储存在-20°C。对于RNA病毒，使用Viral RNA提取和纯化试剂盒（Sangon Biotech，上海）提取RNA，然后使用逆转录试剂盒（Thermo Fisher，美国）合成cDNA，cDNA储存在-20°C。

最优sgRNA的选择

选择了猪伪狂犬病病毒结构基因gB、gD、gE、gI和gG的保守序列来设计sgRNA。初步实验显示gE和gI的扩增效率较低，因此进一步筛选了针对gB、gD和gG保守序列的最优sgRNA。以PRV基因组DNA为模板进行PCR扩增，然后用LbCas12a酶进行切割。切割产物随后进行荧光定量PCR。

讨论

伪狂犬病是由伪狂犬病病毒（PRV）引起的传染性极强的病毒性疾病，给全球养猪业带来了巨大的经济损失。近年来高致病性PRV变种的出现和传播降低了传统疫苗的有效性（An等人，2013年）。这导致了人类罕见的跨物种感染，并引发了严重的脑炎爆发（Liu等人，2021年）。这种情况突显了...

结论

本研究建立了一种使用LAMP-CRISPR/Cas12a检测猪病毒的系统，该系统成本低（约0.5美元）、检测速度快（45~55分钟）、灵敏度高、特异性强，并且结果可视化。这种方法为现场检测猪的病毒性疾病提供了新的途径。

资助

本研究得到了中国国家重点研发计划（2021YFD1301200）、河南省国际科技合作重点项目（251111520200）和河南省科技研究项目（222,102,110,232）的支持。

作者贡献声明

张乐乐：撰写——审稿与编辑、资源管理、数据管理。李聪聪：撰写——初稿撰写、项目管理、资金获取、数据管理、概念构思。徐秋亮：撰写——审稿与编辑、资金获取、数据管理。

利益冲突声明

作者声明与本文的发表没有利益冲突。