《Materials Today Bio》：Biorthogonal click-immobilized probiotic membrane vesicles in a dynamic hydrogel for accelerated and scar-minimized wound healing
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本研究针对慢性复杂伤口难愈合、易留疤的临床难题，开发了一种基于生物正交“点击”化学的益生菌膜囊泡（LCMVs）水凝胶递送系统（Gel-LCMVs）。该研究将干酪乳杆菌衍生的膜囊泡（LCMVs）通过应变促进叠氮-炔环加成反应（SPAAC）共价锚定在羧甲基壳聚糖/醛基透明质酸水凝胶网络中，构建了兼具持续释放和增强生物活性的复合生物材料。该Gel-LCMVs水凝胶在小鼠全层皮肤缺损模型中展现出卓越的促愈合效果，能显著促进细胞增殖、迁移和血管生成，同时有效抑制炎症反应，最终实现了伤口快速闭合和瘢痕最小化。其分子机制与激活PI3K-AKT、Wnt等促修复通路及抑制炎症基因程序有关。这项成果为开发新型、高效的活性伤口敷料提供了创新策略和理论基础。
皮肤是人体最大的器官，当其遭受创伤形成伤口时，一场精密而复杂的生物修复“交响乐”便悄然奏响，包括止血、炎症、增殖和重塑等阶段。然而，对于糖尿病足溃疡、深度烧伤等慢性或复杂伤口而言，这场“交响乐”常常“卡壳”——愈合过程停滞在持续的炎症状态，导致伤口久久不愈，愈合后也常伴随严重的疤痕形成，给患者带来巨大的身心痛苦和经济负担。传统治疗方案，如生长因子、干细胞移植等，常常面临着半衰期短、成本高昂、存在免疫原性风险等局限。因此，临床上亟需一种兼具生物相容性、持续生物活性并能营造有利于组织再生微环境的创新伤口敷料。
细菌膜囊泡（Bacterial Membrane Vesicles, BMVs）是细菌分泌的纳米级细胞外囊泡，具有稳定性好、生产成本低、可规模化等优势，作为一种“无细胞”治疗策略展现出巨大潜力。其中，源自益生菌干酪乳杆菌的膜囊泡（Lactobacillus casei–derived membrane vesicles, LCMVs）不仅保留了母菌株强大的抗炎和再生特性，还具有更低的免疫原性。然而，直接将游离的LCMVs应用于伤口部位，会因其快速降解和被清除而严重削弱疗效。此时，水凝胶作为一种高含水量、可模拟细胞外基质（ECM）结构、并能控制药物释放的理想生物材料，成为递送囊泡的理想载体。但将囊泡简单混入水凝胶通常会导致“突释”现象，即短时间内大量释放，这不仅限制了长期疗效，还可能因局部浓度过高而产生毒性。如何将囊泡稳定地固定在水凝胶中，并实现可控、持续的释放，是这项研究要解决的核心技术瓶颈。为了克服这一难题，研究人员设计了一项巧妙的研究，旨在构建一种能够协同调控伤口微环境、实现加速愈合与最小化疤痕的新型生物活性敷料。相关研究成果发表在材料科学和生物医学交叉领域的知名期刊《Materials Today Bio》上。
本研究综合运用了生物材料合成、纳米技术、细胞生物学和分子生物学等多种关键技术与方法。首先，通过超速离心法从干酪乳杆菌培养上清中提取LCMVs，并利用透射电镜和纳米颗粒追踪分析对其进行表征。其次，利用生物正交的应变促进叠氮-炔环加成点击化学（SPAAC），将表面修饰叠氮基团的LCMVs共价锚定到带有环辛炔基团的羧甲基壳聚糖上，再与醛基化透明质酸交联，构建了Gel-LCMVs水凝胶。利用核磁共振氢谱、扫描电镜、流变学测试等手段对水凝胶的化学结构、微观形貌、力学性能、溶胀/降解及囊泡释放行为进行了系统表征。体外研究使用了人脐静脉内皮细胞、小鼠成纤维细胞和巨噬细胞系，通过CCK-8增殖实验、划痕/Transwell迁移实验、内皮细胞成管实验、qRT-PCR及ELISA等技术评估了材料的生物相容性、促增殖/迁移/血管生成及抗炎活性。体内研究则构建了小鼠全层皮肤缺损模型，通过伤口拍照、组织切片（H&E染色、Masson染色）、免疫组化（检测CD31、VEGF、TNF-α等）评估了水凝胶的促愈合效果。最后，通过对愈合组织进行RNA测序及生物信息学分析（GO、KEGG、GSEA），从转录组层面深入揭示了其分子机制。
提取和表征LCMVs
研究人员从干酪乳杆菌中成功分离出LCMVs，其形态呈典型球形，粒径主要分布在80-100 nm。miRNA测序分析发现，LCMVs富含与伤口愈合、血管发育等生物过程相关的miRNA。生物信息学预测表明，这些miRNA的靶基因富集于MAPK、Wnt、Rap1等与组织修复密切相关的信号通路，提示LCMVs可能通过传递调控性miRNA主动参与细胞间通讯，促进修复。
评估LCMVs对细胞行为的影响
体外细胞实验发现，适当浓度的LCMVs（20 μg/mL）能显著促进人脐静脉内皮细胞和成纤维细胞的增殖、迁移及血管网络形成，同时可上调抗炎因子IL-10、抑制促炎因子TNF-α的表达。然而，过高浓度（40 μg/mL）则显示出促炎效应，证明了其“剂量依赖性”的生物活性，为后续治疗浓度的选择提供了依据。
合成和表征Gel-LCMVs水凝胶
通过SPAAC点击化学成功合成了Gel-LCMVs。与物理混合的对照组（Gel@LCMVs）相比，点击化学固定的囊泡在水凝胶基质中分布更均匀，并能实现长达15天的持续、近线性释放，有效避免了物理混合组的初始“突释”现象（12小时内释放约73%）。Gel-LCMVs保持了水凝胶的多孔微结构、稳定的粘弹性和良好的抗菌性能，其囊泡释放曲线与水凝胶的降解曲线高度同步。
评估Gel-LCMVs的生物学性能
细胞实验表明，Gel-LCMVs能持续、显著地促进内皮细胞和成纤维细胞的增殖、迁移及血管生成，效果远优于单纯水凝胶和物理混合组。Gel@LCMVs因初期“突释”导致局部囊泡浓度过高，反而对细胞产生了毒性。这表明共价固定化策略对于维持局部生物活性物质的适宜浓度、实现长期有效刺激至关重要。
评估Gel-LCMVs的体内伤口愈合效果
在小鼠全层皮肤缺损模型中，Gel-LCMVs展现出卓越的促愈合能力：术后第3天伤口闭合率即超过50%，第10天接近完全愈合。组织学分析显示，Gel-LCMVs治疗组形成了更厚的新生真皮、更致密的肉芽组织、更丰富的胶原沉积和更多的新生血管。同时，该组伤口中促血管生成因子（VEGF、CD31）的表达在早期（第7天）显著上调，而促炎因子TNF-α的表达则被有效抑制，表明其能同时促进血管新生和缓解炎症，创造有利的愈合微环境。
Gel-LCMVs促进伤口愈合相关信号通路的增强
对伤口组织的RNA测序分析从机制上揭示了Gel-LCMVs的作用。与对照组相比，Gel-LCMVs处理组中有大量基因表达发生改变。基因集富集分析显示，与炎症反应、免疫应答相关的基因程序被抑制，而与表皮发育、皮肤发育、角质化和血管生成相关的基因程序被激活。通路富集分析进一步发现，PI3K-AKT、Wnt和JAK-STAT等经典促修复和促生存信号通路被显著激活。这为观察到的增强细胞行为、促进血管生成和抑制炎症的表型提供了分子层面的解释。
本研究成功开发了一种基于生物正交点击化学的益生菌膜囊泡功能化水凝胶（Gel-LCMVs）。该研究的主要结论和创新意义在于：首先，技术创新：利用温和、高效的SPAAC点击化学，将LCMVs共价固定于水凝胶网络，解决了囊泡递送中“突释”与快速清除的难题，实现了囊泡的长期、可控释放，为生物活性分子的递送提供了新策略。其次，性能卓越：构建的Gel-LCMVs复合材料不仅保持了良好的理化性能，更在体外和体内实验中表现出强大的促细胞增殖/迁移/血管生成活性和显著的抗炎效果，能够显著加速全层皮肤伤口的闭合，并改善愈合质量（肉芽组织更厚、胶原沉积更多、疤痕更小）。最后，机制明晰：转录组学分析从系统生物学角度阐明，Gel-LCMVs通过激活PI3K-AKT、Wnt等促修复通路，同时抑制炎症相关基因程序，协同调控伤口微环境，从而推动高效、高质量的组织再生。
这项研究将益生菌来源的生物活性囊泡与仿生水凝胶材料精妙结合，构建了一个“无细胞”的、具有持续生物活性的治疗平台。它不仅为慢性难愈性伤口提供了一种极具潜力的新型治疗选择，展示了超越商用敷料的性能，更重要的是，为“材料-微生物衍生囊泡”的精准整合提供了全新范式，推动了功能性生物材料在再生医学和先进伤口管理领域的发展。
