《Frontiers in Immunology》：Identification of CCND1 and IL7R as core JAK-STAT pathway genes promoting hepatitis B-related liver fibrosis
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为解决乙型肝炎病毒(HBV)感染所致肝纤维化机制不明、缺乏有效诊断标志物的问题，研究人员聚焦JAK-STAT信号通路，通过多组学整合分析、机器学习建模与实验验证，首次鉴定出CCND1与IL7R为核心促纤维化基因，构建了高诊断效能模型(AUC=0.890)，揭示了二者通过调控免疫微环境协同促进纤维化的新机制，为肝纤维化的精准诊断与靶向治疗提供了新靶点。
在全球范围内，乙型肝炎病毒(HBV)感染仍是一项沉重的公共卫生负担，影响着数亿人的健康。慢性HBV感染如同一颗“定时炸弹”，其最危险的并发症之一便是肝纤维化——肝脏在反复损伤与修复过程中，细胞外基质过度沉积，逐渐形成疤痕组织。若不加控制，肝纤维化将进一步发展为肝硬化甚至肝细胞癌。尽管抗病毒治疗已取得长足进步，但相当一部分患者即使病毒得到抑制，肝纤维化仍会悄然进展，这提示我们，病毒本身并非唯一的“罪魁祸首”，其背后隐藏的宿主分子机制，特别是免疫与纤维化信号网络的异常激活，才是推动疾病恶化的关键引擎。其中，Janus激酶-信号转导和转录激活因子(JAK-STAT)通路作为连接炎症与纤维化的核心桥梁，其具体哪些“成员”在HBV相关肝纤维化中扮演了关键角色，尚不完全清楚。解开这个谜团，对于开发能阻断纤维化进程的精准治疗策略至关重要。近期，一项发表在免疫学权威期刊《Frontiers in Immunology》上的研究，为我们揭开了这一谜题的重要一角。
为了探寻答案，研究团队设计了一套从“大数据挖掘”到“实验证实”的完整研究路线。他们首先从公共基因表达数据库(GEO)中获取了HBV相关肝纤维化患者的转录组数据集(GSE84044)，将样本分为纤维化组与对照组。随后，运用了包括差异表达分析、加权基因共表达网络分析(WGCNA)在内的生物信息学方法筛选候选基因。为了从海量数据中精准“锁定”目标，他们构建了一个包含113种算法组合的机器学习框架进行评估和筛选。在确定核心基因后，研究进一步深入，通过基因集富集分析(GSEA/Gene Set Enrichment Analysis)和基因集变异分析(GSVA)探索基因功能，利用CIBERSORT算法剖析免疫微环境变化，并采用孟德尔随机化(Mendelian Randomization, MR)分析来验证基因与疾病间的潜在因果关系。此外，他们还构建了miRNA(微小核糖核酸)-mRNA(信使核糖核酸)-TF(转录因子)调控网络，利用单细胞RNA测序(scRNA-seq)技术在细胞水平验证基因表达模式，并最终通过蛋白质免疫印迹(Western blot)和实时定量聚合酶链式反应(qPCR)实验在细胞模型中对核心基因的表达进行了验证。
3.1 差异表达基因鉴定与功能分析
通过对比分析，研究者在纤维化组织中鉴定出417个差异表达基因(DEGs)，其中351个上调，66个下调。功能富集分析显示，这些基因显著富集于细胞杀伤、白细胞迁移、趋化作用等免疫相关生物学过程，以及与胶原蛋白相关的细胞外基质结构，初步提示免疫调节在HBV肝纤维化中的核心地位。
3.2 加权基因共表达网络分析
WGCNA识别出一个与肝纤维化表型高度相关的基因模块（蓝色模块）。将该模块基因与差异表达基因及已知的JAK-STAT通路基因取交集，得到了7个候选基因。这些基因在功能上涉及白细胞增殖、免疫及JAK-STAT级联调控。
3.3 通过机器学习鉴定JAK-STAT核心基因并构建诊断模型
研究团队利用机器学习对7个候选基因进行评估，最终筛选出由StepGLM[backward]和随机森林(RF)算法组合构建的诊断模型性能最优。该模型仅包含两个核心基因：CCND1（细胞周期蛋白D1）和IL7R（白细胞介素7受体）。在训练集和验证集中，该模型的平均曲线下面积(AUC)达到0.890，表现出优异的诊断性能。分析显示，CCND1和IL7R在纤维化肝组织中表达均显著上调，且两者呈正相关，提示可能存在协同作用。
3.4 探索CCND1和IL7R的潜在功能
GSEA分析表明，CCND1主要富集于抗原受体介导的信号通路、T细胞迁移等免疫调节功能；而IL7R则富集于细胞因子-细胞因子受体相互作用、T/B细胞受体信号通路等典型的免疫应答通路。GSVA分析进一步揭示，CCND1高表达与癌症相关通路激活有关，而IL7R高表达则与免疫反应通路密切相关。
3.5 免疫微环境分析
免疫浸润分析发现，与对照组相比，纤维化组中M1型巨噬细胞显著增多，而静息自然杀伤(NK)细胞减少。相关性分析显示，CCND1和IL7R的表达均与M1型巨噬细胞呈正相关，而与具有抗纤维化潜能的M2型巨噬细胞呈负相关，提示这两个基因可能通过促进促炎型巨噬细胞极化来恶化免疫微环境，加速纤维化。
3.6 孟德尔随机化分析
为探究因果关系，研究者进行了孟德尔随机化分析。结果发现，IL7R对肝纤维化风险具有显著的正向因果效应（逆方差加权法，IVW，比值比OR=1.20），而CCND1虽显示出正向趋势，但未达到统计学显著性。这为IL7R作为驱动肝纤维化进展的因果基因提供了强有力的遗传学证据。
3.7 构建miRNA-mRNA-TF相互作用网络
研究构建了以CCND1和IL7R为核心的调控网络，发现了47个可靶向调控这两个基因的miRNA和13个转录因子。值得注意的是，hsa-miR-26b-5p可同时调控CCND1和IL7R，而该miRNA已被报道具有抑制肝纤维化的作用，这提示通过上调此类miRNA来同时抑制两个核心基因，可能成为一种潜在的治疗策略。
3.8 单细胞测序分析
利用单细胞RNA测序技术，研究在细胞分辨率水平验证了核心基因的表达模式。CCND1在上皮细胞、内皮细胞、肝细胞、肝星状细胞(HSCs)和巨噬细胞中高表达；而IL7R则特异性高表达于T/NK细胞。伪时间轨迹分析进一步显示，CCND1在轨迹早期（巨噬细胞/中性粒细胞阶段）高表达，而IL7R在轨迹晚期（T/NK细胞阶段）高表达，揭示了它们在纤维化进程中可能存在时序性的协同作用。
3.9 蛋白质免疫印迹和qPCR验证
最后，通过细胞实验证实，在经HBV感染和转化生长因子-β1(TGF-β1)处理的肝细胞纤维化模型中，CCND1和IL7R在mRNA和蛋白水平的表达均显著高于对照组，这与生物信息学分析结果完全一致，从实验层面验证了核心基因的上调。
综上所述，这项研究通过多层次、多维度的整合分析，系统性地鉴定出CCND1和IL7R是JAK-STAT通路中驱动HBV相关肝纤维化的两个核心基因。其中，IL7R被证明对肝纤维化具有显著的因果效应，是一个潜在的致病驱动因子；而CCND1则表现出优异的诊断性能，可作为可靠的生物标志物。两者在纤维化肝组织中表达上调且正相关，通过不同的细胞类型（CCND1在实质细胞与基质细胞，IL7R在免疫细胞）和不同的时序（早期与晚期）协同作用，共同调节以M1型巨噬细胞增多为特征的促纤维化免疫微环境，从而推动疾病进展。基于两者构建的诊断模型具有很高的判别能力。该研究不仅深化了对HBV肝纤维化分子机制，特别是JAK-STAT通路具体作用节点的理解，还为该疾病的早期无创诊断提供了新的双基因标志物组合，并为开发针对CCND1（尤其作为诊断靶点）和IL7R（作为治疗靶点）的精准干预策略奠定了坚实的理论基础。未来的研究可在此基础上，探索靶向这些基因的小分子抑制剂或基因疗法，并推动其向临床应用转化。
