《Frontiers in Immunology》：Broadly neutralizing single-domain antibody targeting the spike NTD displays therapeutic efficacy against diverse SARS-CoV-2 variants
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为应对SARS-CoV-2持续变异导致现有疗法失效的挑战，研究者鉴定出一种靶向病毒刺突蛋白N端结构域(NTD)的广谱中和单域抗体1p2B5。其Fc融合形式(1p2B5-Fc)在体外对包括早期和当前流行株在内的多种变体展现出纳摩尔级中和活性，在叙利亚仓鼠和hACE2转基因小鼠模型中，1 mg/kg的系统性治疗可有效降低肺部病毒载量并防止死亡。该研究揭示了NTD作为保守中和表位的潜力，为开发新一代抗新冠病毒广谱疗法提供了有希望的候选分子。
新冠病毒(SARS-CoV-2)引发的疫情已过去数年，但这场与病毒的较量远未结束。病毒像一位狡猾的“变形者”，通过不断变异来躲避我们免疫系统和原有药物的追击。其中，奥密克戎(Omicron)及其后代变种凭借刺突蛋白(Spike protein, S蛋白)上的大量突变，使得许多曾经有效的治疗性抗体纷纷“失明”失效。这给临床治疗，特别是为免疫缺陷患者和高危人群提供保护，带来了严峻挑战。因此，科学界的目光投向了寻找病毒身上那些不易随变异而改变的“阿喀琉斯之踵”——保守的中和表位。大多数抗体瞄准的是S蛋白上与人体细胞受体ACE2结合的关键区域——受体结合域(RBD)，然而这个区域恰恰是突变的热点。相比之下，S蛋白的另一个部分，N端结构域(NTD)，虽然也积累了一些突变，但其某些区域可能更为保守，成为了开发广谱抗体的新希望。那么，能否找到一种抗体，它能牢牢锁住NTD上的保守位点，从而有效地中和从原始毒株到最新变异株的多种新冠病毒呢？近期发表在《Frontiers in Immunology》上的一项研究，带来了一个令人振奋的答案。
为了探索这一问题，研究团队开展了一项系统性的研究。他们从免疫了多种SARS-CoV-2 S蛋白亚型的双峰驼驼源单域抗体(VHH)噬菌体展示库中，通过筛选，鉴定出了一株名为1p2B5的单域抗体。随后，他们构建了其与人IgG1 Fc片段融合的蛋白(1p2B5-Fc)，以增强其潜在活性。研究综合运用了酶联免疫吸附试验(ELISA)和生物层干涉技术(BLI)分析抗体结合活性与亲和力；使用活病毒中和试验评估抗体对多种流行变异株（如武汉D614G、XBB.1.9.1、EG.5.1、JN.1、KS.1、XFG.3等）的中和能力；通过竞争ELISA和细胞-细胞膜融合抑制实验探究抗体的作用机制；并利用抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)和抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)报告系统检测Fc介导的效应功能。关键的体内疗效评估则在叙利亚仓鼠和表达人ACE2的转基因(K18-hACE2)小鼠模型中进行，动物感染不同病毒变种后，在不同时间点给予1p2B5-Fc治疗，通过检测肺部病毒载量、生存率和体重变化来评价保护效果。文中使用的病毒毒株来源于俄罗斯国家病毒保藏中心，动物实验获得了相关伦理委员会的批准。
3.1 靶向NTD的单域抗体可广谱中和SARS-CoV-2变体
研究人员首先发现，1p2B5能以高亲和力结合Delta、Omicron B.1.1.529和XBB.1等多种变异株的S蛋白。生物层干涉分析显示，其与XBB.1变体NTD的解离常数(KD)低至4.4×10-10M，表明结合非常牢固。在活病毒中和试验中，1p2B5对武汉D614G、XBB.1.9.1、EG.5.1、XBB.1.16、JN.1和KS.1等变异株均表现出强大的中和能力，半数有效浓度(EC50)在0.17-1.23 nM之间。然而，其对当时最新流行的XFG.3变体的中和活性显著下降，所需浓度高达116 nM。
3.2 Fc融合形式的1p2B5具有更强的中和活性
将1p2B5与IgG1的Fc片段融合后，得到的1p2B5-Fc抗体中和能力显著提升。它不仅对上述变体的中和浓度降至0.05-0.7 nM，更关键的是，对原本不敏感的XFG.3变体也获得了有效中和能力，浓度仅为7.39 nM。这表明Fc融合带来的二价形式（即两个抗原结合位点）可能通过提高功能性亲和力，拓宽了抗体的中和广度。
3.3 1p2B5-Fc可在动物体内抵抗SARS-CoV-2攻击
在动物模型中，1p2B5-Fc展现出卓越的治疗效果。在叙利亚仓鼠模型中，感染后1小时注射1 mg/kg的1p2B5-Fc，能显著降低由武汉D614G、XBB.1.16、EG.5.1、XBB.1.9.1、JN.1和KS.1等多种变体引起的肺部病毒载量（降低超过2个对数级）。即使将给药时间推迟到感染后6小时或24小时，对B.1.1.1和JN.1变体感染仍能实现大于3个对数级的病毒载量降低。
在致命的hACE2转基因小鼠模型中，感染武汉D614G变体后1、6或24小时给予相同剂量的1p2B5-Fc，能保护100%的小鼠免于死亡，并防止其体重下降。
3.4 1p2B5的中和与保护活性机制
为阐明其作用机制，研究人员进行了深入探究。竞争ELISA实验表明，1p2B5并不能有效阻断S蛋白与ACE2受体的结合，提示其中和作用不依赖于干扰病毒附着。然而，在细胞-细胞膜融合实验中，1p2B5-Fc能够完全抑制表达S蛋白的细胞融合形成合胞体，这说明它通过阻断病毒与宿主细胞膜的融合过程来发挥中和作用。
此外，研究还探讨了抗体Fc段介导的效应功能（如ADCC和ADCP）是否贡献于其治疗效果。通过引入LALA-PG突变（L234A, L235A, P329G）削弱Fc与Fcγ受体的结合，得到了效应功能缺陷的突变体1p2B5-Fc-LALA-PG。报告基因实验证实该突变体失去了诱导ADCC和ADCP的能力。然而，在hACE2转基因小鼠的攻毒保护实验中，原始的1p2B5-Fc与其LALA-PG突变体在提供完全保护、防止体重下降和降低肺部病毒载量方面效果相当，无统计学差异。这表明1p2B5-Fc在体内的保护功效主要归功于其强大的直接中和能力，而非Fc介导的免疫细胞招募作用。
该研究的结论与讨论部分强调，在全球SARS-CoV-2持续变异、原有单抗疗法相继失效的背景下，寻找针对保守表位的广谱中和抗体至关重要。本研究成功鉴定出一种靶向刺突蛋白NTD的单域抗体1p2B5。其核心发现在于：首先，1p2B5本身对包括多种奥密克戎亚型在内的SARS-CoV-2变异株具有广泛的纳摩尔级中和活性；其二，将其改造为Fc融合的二价形式（1p2B5-Fc）后，其中和广度与效力均得到增强，甚至能有效中和对其单价形式不敏感的最新变体XFG.3；其三，也是最具转化潜力的发现，是1p2B5-Fc在两种动物模型中展现出强大的治疗功效。低至1 mg/kg的剂量，即使在感染后24小时给药，仍能显著降低由多种进化距离较远的变异株引起的肺部病毒载量，并在致命性感染模型中实现100%的保护。这为开发可用于临床的、具有广谱活性的新冠肺炎治疗药物提供了强有力的候选分子。
在作用机制上，该研究澄清了1p2B5并非通过阻断病毒与ACE2受体结合，而是通过抑制病毒与细胞膜的融合来发挥作用。同时，通过巧妙的突变体对比实验，证明了其体内保护作用主要依赖于抗体本身卓越的中和能力，而非Fc段介导的“额外”免疫系统助攻。这凸显了1p2B5作为一种高效中和剂的内在价值。
总之，这项研究不仅报道了一个具有高度开发前景的广谱抗新冠病毒单域抗体候选物，也再次验证了刺突蛋白NTD作为保守中和表位的重要性。尽管NTD区域存在突变，但其特定部位仍可衍生出强效、广谱的中和抗体。对于1p2B5所识别的精确表位进行后续结构解析，将有助于我们更深入理解新冠病毒的保守脆弱位点，为设计下一代通用型冠状病毒疫苗和疗法奠定坚实基础。在病毒变异层出不穷的今天，这项研究为应对未来可能出现的新的病毒变种带来了新的希望和武器。
