《Frontiers in Pharmacology》：Targeting leukemic stem and progenitor cells expressing different BCR::ABL1 levels: antileukemic activity of asciminib with or without TKIs
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阿西米尼（ASC）是一种靶向ABL1豆蔻酰口袋（STAMP）的新型变构抑制剂，为解决TKIs难以根除白血病干细胞（LSC）导致疾病复发的问题提供了新策略。本研究探讨了ASC单用或联合伊马替尼/尼洛替尼，对高/低BCR::ABL1转录本水平的CML患者LSC和定向祖细胞的细胞毒性作用。研究显示，ASC可抑制LSC自我更新，并能在高BCR::ABL1表达的LTC-IC中恢复TKI敏感性。这些发现为ASC用于靶向LSC、改善CML患者预后，特别是诊断时高BCR::ABL1表达的患者提供了机制依据。
慢性髓系白血病（CML）是一种由BCR::ABL1融合癌基因驱动的血液肿瘤。靶向ABL1激酶催化活性的酪氨酸激酶抑制剂（TKI，如伊马替尼、尼洛替尼等）的出现，极大地改善了CML患者的预后，能够诱导持久而深刻的治疗反应。然而，尽管TKI能够有效抑制分化的白血病祖细胞，它们却无法彻底根除疾病的源头——白血病干细胞。这些干细胞具有自我更新和长期存活的能力，并对TKI不敏感，被认为是导致治疗失败、疾病复发，以及患者难以实现治疗无缓解的主要原因。此外，临床研究发现，诊断时高水平的BCR::ABL1转录本与疾病进展风险增加相关，提示这部分患者的治疗更具挑战性。因此，开发能够有效清除白血病干细胞的新疗法，是CML治疗领域亟待解决的关键问题。
针对这一难题，一类名为“特异性靶向ABL1豆蔻酰口袋”的新型小分子药物应运而生，阿西米尼便是其中首个获批的药物。与传统的TKI不同，ASC不结合ABL1的ATP结合位点，而是变构性地结合于豆蔻酰口袋，稳定ABL1的非活性构象，从而提供了一种全新的抑制机制。ASC已被批准用于既往接受过一种或多种TKI治疗的CML患者，但其对不同BCR::ABL1水平背景下的白血病干细胞的疗效，以及联合TKI的潜力，仍有待深入阐明。为此，研究人员开展了一项研究，旨在探究ASC单独或联合TKI，如何靶向表达不同水平BCR::ABL1的白血病干细胞和定向祖细胞，为克服现有治疗瓶颈、实现深度缓解提供新思路。这项研究发表在《Frontiers in Pharmacology》杂志上。
为评估阿西米尼的疗效，研究人员从诊断为慢性期CML的患者骨髓中分离出CD34阳性细胞，并根据诊断时BCR::ABL1/GUSIS（国际标准）转录本水平，将其分为低水平（<10%）和高水平（>20%）两组，分别标记为CD34BALow和CD34BAHigh。研究使用了两种核心的体外功能实验模型：一是克隆形成单位（CFU）实验，用于评估定向祖细胞的增殖和分化潜能；二是长期培养起始细胞（LTC-IC）实验，这是一种能够评估白血病干细胞（LSC）自我更新、长期存活和产生后代克隆能力的关键技术。通过这两种方法，研究人员系统地评估了ASC、伊马替尼、尼洛替尼单用及联合应用对细胞的细胞毒性、自我更新相关参数（包括LTC-IC频率、数量、分裂速率和CFU生成）以及BCR::ABL1激酶活性的影响。
1. ASC降低了CD34BALow定向祖细胞的克隆形成潜能，但对CD34BAHigh细胞影响有限
通过CFU实验，研究人员评估了药物对细胞克隆形成能力的影响。结果显示：
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ASC能有效降低CD34BALow细胞中总CFU、红系祖细胞（CFU-E/BFU-E）和粒-单核系祖细胞（CFU-GM）的集落形成，表明其可抑制低BCR::ABL1水平定向祖细胞的增殖。
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然而，ASC对CD34BAHigh细胞的克隆形成能力影响甚微，尤其是在红系祖细胞方面未能显示出显著效果。
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相比之下，伊马替尼和尼洛替尼无论对高、低表达组都表现出更强效的克隆形成抑制活性。当ASC与TKI联合使用时，并未在CFU抑制上展现出额外的协同效应，这可能是因为TKI单药已产生很强的细胞毒性。ASC及其联合方案对健康供者的CD34阳性细胞毒性很低，表明其安全性较好。
2. ASC降低定向祖细胞中CRKLY207的磷酸化水平
CRKL蛋白是BCR::ABL1的主要底物之一，其第207位酪氨酸的磷酸化水平是BCR::ABL1激酶活性的间接标志物。通过细胞内蛋白质印迹法（In-cell Western）检测发现，ASC能够降低CRKLY207的磷酸化水平，且在CD34BALow细胞中的抑制效果比在CD34BAHigh细胞中更明显。ASC与TKI联用并未在CRKL磷酸化抑制上产生叠加效应，这进一步支持了ASC的抑制效果与BCR::ABL1的转录水平相关。
3. ASC干扰白血病干细胞的自我更新
LTC-IC实验是评估白血病干细胞自我更新能力的金标准。研究评估了四个关键参数：LTC-IC频率、数量、分裂速率和CFU生成能力。结果表明：
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ASC能够显著降低LTC-IC频率，其效果优于伊马替尼和尼洛替尼，且无论BCR::ABL1表达水平高低均有效。值得注意的是，在CD34BAHigh细胞中，ASC联合TKI可进一步降低LTC-IC频率，恢复了TKI对高表达细胞的敏感性。
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在减少LTC-IC绝对数量方面，ASC同样有效，且对CD34BAHigh细胞作用更强。联合TKI并未带来额外获益。
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在评估LTC-IC分裂速率时，仅ASC与尼洛替尼的联合方案能够显著降低高、低表达组的干细胞分裂速率，这可能与尼洛替尼更强的激酶抑制效力有关。
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在检测LSC的克隆形成潜能（LTC-IC来源的CFU）时，发现ASC单药可有效抑制CD34BALow细胞的CFU生成，但对于CD34BAHigh细胞，只有ASC与尼洛替尼联合使用时才能显著减少CFU。这提示ASC联合尼洛替尼可能是靶向高BCR::ABL1水平LSC的更有效策略。20%, with statistical significance indicated by asterisks. Panel A: LTC-IC frequency. Panel B: Number of LTC-IC. Panel C: LTC-IC division rate. Panel D: LTC-IC-derived CFUs. Treatments ASC, IM, NIL are indicated for each group.">
本研究的结论与讨论强调了ASC在慢性髓系白血病治疗中的独特价值。尽管ASC在抑制定向祖细胞克隆形成方面不如TKI强效，但它展现出了靶向并破坏白血病干细胞自我更新的卓越能力，这是TKI所不具备的特性。尤其重要的是，ASC能够恢复TKI对高BCR::ABL1水平表达的LTC-IC的敏感性。ASC与尼洛替尼的联合使用，可同时降低LTC-IC的分裂速率和高BCR::ABL1水平LSC的克隆形成潜能，显示了协同作用的潜力。
这些发现为ASC的临床应用，特别是作为一线治疗或联合治疗策略，提供了重要的临床前机制依据。鉴于实现治疗无缓解是CML治疗的主要目标，而白血病干细胞的持续存在是导致分子学复发（molecular relapse）的主要原因，开发能够有效清除白血病干细胞的策略至关重要。ASC通过一种不同于TKI的全新机制，直接作用于白血病干细胞的维持机制，为根除残留疾病、实现深度和持久的分子学缓解带来了新希望。特别是对于诊断时BCR::ABL1高表达、传统TKI疗效可能欠佳的患者群体，ASC单用或与尼洛替尼联合的方案，可能成为一种有前景的治疗策略，有助于改善这部分患者的长期预后，并最终推动更多患者安全地实现治疗无缓解的目标。
