一种用于色团-DNA结合物的固相click2策略及其作为光捕获系统的应用

《Chemical Communications》：A solid-phase click2 strategy for chromophore–DNA conjugates and their application as a light harvesting system

两步正交点击反应在固相合成DNA中得到应用，通过5′-乙炔基尿苷与azide修饰卟啉以及5′-碘代尿苷生成azide中间体与炔基pyrene的修饰实现双功能化DNA构建。光谱分析表明DNA结构促进激子分裂和超快电子转移，双修饰DNA表现出高效荧光淬灭，为光捕获系统提供新方法。

　　

一种逐步且正交的方法，通过两次独立的点击反应直接在固相上进行，可以轻松获得双重修饰的DNA。首先，5′-乙炔基-2′-脱氧尿苷与叠氮修饰的卟啉直接反应；其次，5′-叠氮-2′-脱氧尿苷在5′-碘代-2′-脱氧尿苷的基础上原位生成，这使得它能够与炔基功能化的芘进行点击反应。这种双重修饰的DNA被表征为一种光捕获系统。

铜催化的叠氮-炔环加成（CuAAC）^1,2已成为一种强大而高效的生物分子后合成功能化工具，特别是对于DNA而言，它绕过了每次DNA修饰都需要复杂合成修饰磷酰胺酸酯作为构建块的需求，并简化了修饰DNA的纯化过程。^3–7 传统上，这是通过使用含有炔基的构建块（如5′-乙炔基-2′-脱氧尿苷（EdU）与有机叠氮化合物反应来实现的。⁸ 然而，相反的方法需要合成带有叠氮基团的DNA。然而，许多叠氮化合物在基于磷的自动化DNA合成过程中的不稳定性往往限制了这种方法的应用，使其在文献中仅作为少数例子出现。^5,9 我们通过在序列中合成含有5-碘代-2′-脱氧尿苷（IdU）的DNA来解决这个问题，这种DNA可以在原位形成中间体5-叠氮-2′-脱氧尿苷（AdU）后，选择性地用乙炔修饰的尼罗红作为荧光标记进行后合成修饰。³ 基于这种方法，我们在本文中报告了结合EdU和IdU进行两次独立的正交点击反应，从而实现了一种具有完全序列控制的双重点击²后合成DNA标记策略（图1）。

图1 通过使用5-乙炔基-2′-脱氧尿苷（X）进行第一次点击反应与叠氮化合物1，以及将5-碘代-2′-脱氧尿苷原位转化为5-叠氮-2′-脱氧尿苷（Y）与炔基2进行第二次点击修饰，对预合成的DNA3′进行双重标记。预合成的DNA1′和DNA2′分别作为单次修饰的对照，分别使用叠氮化合物1（DNA1）或炔基2（DNA2）。

所需的寡核苷酸DNA1、DNA2和DNA3设计了随机序列，中间部分含有荧光团修饰，而DNA3中的荧光团由两个间隔的碱基对分隔，并使用市面上容易获得的磷酰胺酸酯EdU和IdU及其相应的前体DNA1′、DNA2′和DNA3′>进行合成。标准的偶联协议确保了这两种人工核苷酸能够高效地整合到链中。¹⁰

随后，预合成的寡核苷酸（1 μmol）没有从固体支持物（可控孔玻璃，CPG）上分离。第一次后合成修饰是通过将DNA1′和DNA3′序列中的乙炔基与卟啉叠氮化合物1（10当量）进行CuAAC反应来实现的（50当量抗坏血酸钠，11当量TBTA配体，¹¹，30当量Cu(CH₃CN)₄PF₆，室温下反应15小时）。正如预期的那样，并通过HPLC测定，第一次点击修饰几乎以定量效率进行。为了引入1-乙炔基芘2作为第一个或第二个标记，从预合成的DNA2′或DNA3′中的IdU前体原位生成叠氮基团，通过用叠氮化钠（200 μmol在DMSO中，50 °C下反应1小时）处理。所得到的寡核苷酸立即在与形成DNA1相同的条件下与1-乙炔基芘2（50当量）进行点击反应。选择芘作为第二个荧光团修饰在策略上具有重要意义。(i) 它的UV/Vis吸收与卟啉的吸收有很好的分离。(ii) 1-乙炔基芘在市场上可以买到。(iii) 吡rene能够诱导DNA中的电子转移。^12,13 总之，吡rene/卟啉对非常适合用于通过光谱手段实现的光捕获系统。^14,15 通过ESI质谱证明了DNA1–DNA3的成功修饰。有趣的是，对DNA1和DNA3的MS分析显示了Cu(ii)的配位，这可能是由于卟啉作为配体的存在。

在成功合成荧光团-DNA结合物DNA1、DNA2和DNA3之后，我们使用光学光谱方法对其光物理性质进行了表征，包括UV/Vis吸收光谱、稳态和时间分辨荧光光谱以及圆二色性（CD）光谱（图2）。对于吡rene来说，我们确定了双链DNA2的熔点为40 °C。然而，庞大的卟啉修饰严重干扰了退火过程，因此无法观察到与DNA1和DNA3的互补未修饰链的稳定杂交，因此无法确定熔点。因此，我们仅使用单链DNA1、DNA2和DNA3进行表征。它们的UV/Vis吸收光谱（图2a）显示了典型的核酸最大吸收峰在λ = 260 nm处，以及吡rene峰在λ = 350 nm处，还有一个强烈的卟啉Soret峰在λ = 419 nm处，伴随着Q带在λ = 550–600 nm范围内。^16,17 单链还显示了DNA的特征螺旋结构，圆二色性（图2c）揭示了B-DNA的特征Cotton效应，在λ = 275 nm处有正峰，在λ = 250 nm处有负峰。Soret峰内的负Cotton效应表明了卟啉大环在核碱基对之间的空间取向。在λ = 400–450 nm范围内检测到了显著的激子分裂，这是由于DNA3中两种不同荧光团之间的强基态相互作用。^18–20 基础区域的小强度变化仅表明修饰位点附近的局部结构调整。¹⁷ 显然，两个荧光团之间的两个间隔碱基对就足够了。与荧光团1和2相比，荧光光谱（图2b）显示了由于这些荧光团与DNA1和DNA2的共价结合而导致的明显发射淬灭。在单标记的DNA2中，卟啉荧光显著减弱。在双标记的DNA3中，卟啉和吡rene的发射几乎完全被淬灭。这表明荧光团的激发态具有高效的非辐射衰减途径。通过TCSPC进行的时间分辨荧光测量证实了这一解释，显示DNA3在λ_exc = 370 nm处激发时，τ = 0.13 ns的发射平均寿命，而未标记的吡rene衍生物2在相同浓度下的典型寿命τ₀ = 6.4 ns（由于色素在水介质中的溶解度限制）。^21–24 这对应的淬灭效率E超过95%，根据E = 1 ? (τ/τ_{0计算得出，其中τ和τ0分别表示与DNA共价结合的荧光团的荧光寿命（τ）和未与DNA结合的荧光团的荧光寿命（τ0）。}

图2 (a) DNA1–DNA3（每种2.5 μM，溶于10 mM磷酸钠缓冲液，pH 7.0，250 mM NaCl）和未标记的荧光团1和2（每种2.5 μM，溶于DMSO）的UV/VIS吸收光谱，λ_exc = 350 nm。由于DMSO作为溶剂的截止效应，1和2的UV/Vis吸收在λ = 300 nm以下被截断。

估计的淬灭速率常数k = 0.16 × 10⁹ s^?1处于超快光诱导电子过程的典型范围内。^23,25,26 基于荧光团的氧化还原电位ΔG_ET = E_ox ? E_red ? E₀₀（忽略库仑相互作用E_C）的定性Rehm–Weller估算²³支持了这种双荧光团DNA中光诱导电荷分离的热力学可行性：这种电荷分离使卟啉减少一个电子并氧化吡rene，这是基于四苯基卟啉的还原电位E_red = ?1.05 V（vs. SCE），²⁷E₀₀ = 3.25 V^28,29以及吡rene的氧化电位E_ox = 1.28 V（vs. SCE）^28,29，从而产生一个强烈的放能驱动力ΔG_ET = ?0.92 V。²⁹

我们开发了一种新颖的、逐步的正交点击²策略，该策略在自动化DNA合成后直接在固体支持物上进行。这种方法利用了容易获得的磷酰胺酸酯前体（EdU和IdU）来引入任何可能被叠氮或乙炔基修饰的荧光团。我们用卟啉和芘作为代表测试了这种合成方法，它们有效地标记了DNA。光谱数据表明，DNA螺旋作为一个预组织的支架，将供体和受体荧光团定位在大约1–1.5 nm的距离上，从而促进了超快的电子转移过程。在双重修饰的DNA中几乎完全的荧光淬灭不能归因于广泛的结构变性或激子离域，而是一个高效的、由DNA介导的非辐射松弛机制。我们的方法扩展了用于合成复杂的多荧光团DNA组装体的工具箱，适用于光捕获系统和分子电子学应用。

没有需要声明的利益冲突。

数据可用性

支持本文的数据已作为补充信息（SI）的一部分包含在内。补充信息包括所有实验数据、合成程序和光谱实验。详见DOI: https://doi.org/10.1039/d6cc00319b。

致谢

特别感谢德国研究基金会（DFG）（项目Wa 1386/27-1）、化学工业基金会（FCI）和卡尔斯鲁厄理工学院（KIT）的财政支持。

参考文献