《Advanced Healthcare Materials》：A Physiological Microfluidic Blood–Brain-Barrier Model for In Vitro Study of Nanoparticle Trafficking and Accumulation
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本文旨在解决传统血脑屏障（BBB）模型在解析纳米颗粒（NPs）穿透机制方面的局限。研究人员构建了一种包含人脑微血管内皮细胞、星形胶质细胞和周细胞的三细胞共培养生理性微流控血脑屏障模型（mBBB）。研究表明，不同来源的纳米颗粒（如细胞外囊泡、脂质体和纳米塑料）穿越BBB的效率和机制存在显著差异，其中异源性细胞外囊泡（EVs）转运效率最高。该研究为理解纳米颗粒的脑部递送机制和神经毒性筛查提供了高通量、可成像的转化研究工具。
我们的大脑被一层精密的“城墙”严密守护着，这就是血脑屏障。它由内皮细胞、周细胞和星形胶质细胞紧密连接构成，严格限制血液中的有害物质进入脑组织，但同时也将超过98%的潜在治疗药物挡在门外。一个令人费解的现象是，尽管细胞间隙仅有几纳米宽，一些尺寸大得多的纳米颗粒，如用于药物递送的合成载体、细胞间通讯的细胞外囊泡，甚至环境污染物纳米塑料，却能在脑组织中被检测到。这种现象既为脑部疾病治疗带来了新希望，也引发了对其潜在神经毒性的担忧。然而，要厘清这些纳米颗粒是如何“翻越”血脑屏障这座高墙的，却面临着巨大挑战。传统的体外模型，如Transwell小室，难以复现BBB复杂的细胞空间结构和生理微环境，限制了高分辨率成像和机制研究。因此，开发一个能模拟人BBB关键特征、并能直观、定量研究纳米颗粒运输与累积的体外平台，对于推动脑部靶向纳米药物的理性设计以及评估环境纳米颗粒的神经毒性至关重要。
为此，研究人员在《Advanced Healthcare Materials》上发表了一项研究，他们成功构建了一个生理相关的微流控血脑屏障模型，并利用该系统系统比较了不同纳米颗粒穿越BBB的行为与机制。
为开展此项研究，研究人员主要采用了以下几项关键技术方法：1. 微流控器件设计与制备：利用软光刻技术制造了具有水平平行通道结构的微流控芯片，实现了内皮细胞、星形胶质细胞和周细胞在仿生细胞外基质中的空间限定共培养。2. 细胞外囊泡（EVs）的规模化生产与表征：使用CELLine生物反应器扩增培养HEK 293T和MDA-MB-231-Br细胞，并通过差速离心结合尺寸排阻色谱法分离纯化EVs，利用纳米颗粒追踪分析、冷冻电镜和四跨膜蛋白免疫捕获 assay 对其进行表征。3. 合成纳米颗粒的制备：采用微流控混合技术制备了聚乙二醇化荧光脂质体，并使用了商品化的荧光聚苯乙烯纳米塑料珠（26 nm和100 nm）。4. 高分辨率成像与定量分析：利用共聚焦显微镜对模型结构、蛋白表达、纳米颗粒积累和渗透过程进行时间 lapse 成像和空间定量分析。5. 功能性渗透性测定：通过测量70 kDa FITC-葡聚糖、多柔比星和FITC-转铁蛋白的跨屏障运输，定量评估BBB模型的完整性和功能。
研究结果
2.1 验证用于研究纳米颗粒运输的BBB微流控模型
研究人员成功构建了微流控血脑屏障模型。该模型具有水平平行的通道结构，中央“血管”通道铺覆人脑微血管内皮细胞，两侧通道则包埋了原代人星形胶质细胞和周细胞的细胞外基质。这种设计实现了三种细胞在微孔界面的直接接触，模拟了体内BBB的空间微环境。免疫荧光染色证实模型表达紧密连接蛋白、间隙连接成分以及多种关键的转运蛋白和外排蛋白。功能测试显示，模型对70 kDa FITC-葡聚糖的渗透性极低，对P-糖蛋白（P-gp）底物多柔比星的渗透性更低，证明了功能性外排转运体的活性。使用动力蛋白抑制剂Dynasore和巨胞饮抑制剂丙咪嗪进行药理学干预，证实了模型中存在并可调控的内吞途径。
2.2 不同纳米颗粒类型表现出不同的物理和生化特性
研究选取了三种主要类别的纳米颗粒进行比较：来源于异源细胞系的细胞外囊泡、合成脂质体以及两种尺寸（26 nm和100 nm）的聚苯乙烯纳米塑料。通过冷冻电镜、纳米颗粒追踪分析、扫描电镜和免疫捕获 assay 等技术对这些颗粒的形态、尺寸分布和分子组成进行了详细表征，确保它们涵盖了广泛的性质范围，以研究特定特征如何影响BBB运输。
2.3 纳米颗粒表现出依赖于来源的BBB运输和积累差异
将mBBB模型暴露于五种纳米颗粒16小时后，通过共聚焦显微镜评估其积累和运输情况。结果表明，不同纳米颗粒的运输行为差异显著。HEK 293T来源的EVs在细胞外基质中表现出最显著的积累和穿透，MDA-MB-231-Br EVs也有一定运输，但程度较低。相比之下，裸露的脂质体和两种尺寸的聚苯乙烯珠则很少能穿越内皮单层，大多局限于管腔表面。定量图像分析证实了这些观察结果。
2.4 BBB渗透性因纳米颗粒在内皮细胞的相互作用而选择性破坏
为了评估纳米颗粒暴露是否会破坏BBB完整性，研究人员在纳米颗粒处理后测量了模型对70 kDa FITC-葡聚糖的渗透性。结果表明，HEK 293T EVs和100 nm聚苯乙烯珠能使葡聚糖渗透性增加两到三倍，说明这些颗粒会损害BBB功能。有趣的是，屏障破坏与运输效率并不直接相关。100 nm聚苯乙烯珠穿透性很差，却能引起类似的屏障功能障碍，这提示BBB功能障碍可能源于表面相互作用或间接信号传导，而非颗粒在血管周围空间的大量积累。
2.5 纳米颗粒运输利用BBB上不同的细胞摄取机制
为了阐明调控纳米颗粒跨BBB转胞吞的细胞通路，研究人员选择性抑制了两种主要的内吞机制：动力蛋白介导的内吞作用和巨胞饮作用。使用Dynasore（动力蛋白抑制剂）和丙咪嗪（巨胞饮抑制剂）进行预处理。结果显示，Dynasore显著减少了HEK和MDA-Br EVs的管腔 cargo 和膜运输，表明EVs广泛依赖于动力蛋白依赖的通路。丙咪嗪处理显著降低了HEK EVs的运输，但对MDA-Br EVs影响不显著。相比之下，合成颗粒行为不同：Dynasore反而增加了脂质体的运输。这些结果表明，生物来源的EVs利用主动的、受调控的机制，而合成颗粒的相互作用特异性较低，其运输甚至可能因细胞摄取系统被抑制而增加。
研究结论与讨论
该研究建立了一个高内涵、空间结构化的mBBB模型，作为一个灵活的平台用于探究纳米颗粒与人类BBB的相互作用。该系统支持对运输机制、屏障破坏和结构-功能关系进行详细分析。通过系统比较不同类别的纳米颗粒，研究揭示了BBB运输具有异质性，主要取决于颗粒的来源、膜组成和表面配体的呈现，而非仅仅是尺寸或硬度。具体而言，生物来源的EVs表现出最高的BBB转运效率，并主要依赖动力蛋白介导的内吞和巨胞饮等主动调控途径。相比之下，合成脂质体和纳米塑料的穿透效率很低，后者甚至可能通过表面相互作用破坏屏障完整性而并不进入脑实质。
这些发现具有重要意义。在治疗方面，该研究强调了配体呈现和膜组成对于设计高效脑靶向纳米载体的关键作用，为筛选具有良好BBB穿透能力的EV亚群或合成纳米颗粒提供了框架。在安全评估方面，研究提示某些纳米颗粒（如大尺寸纳米塑料）即使不穿透BBB，也可能通过引起屏障功能障碍产生神经毒性风险，这为环境健康风险评估提供了新视角。该mBBB模型本身作为一个可复制、可成像的高通量平台，弥补了现有体外模型在解析纳米颗粒BBB穿透机制方面的不足，为未来更深入的机制研究、药物递送载体优化以及神经毒性筛查提供了强大的工具。
尽管该模型在细胞类型、3D结构和成像能力上具有优势，但作者也讨论了其局限性，例如使用的水静压驱动间歇流可能无法完全模拟体内连续的剪切应力，HCMEC/D3细胞系中claudin-5表达有限，以及EV标记策略可能带来的偏差等。未来的工作可以整合更多细胞类型（如神经元、小胶质细胞）、实现持续生理灌注，并使用原代或iPSC来源的内皮细胞以进一步提升模型的生理相关性和预测能力。总的来说，这项研究通过创新的模型和系统的比较分析，深化了对纳米颗粒与血脑屏障相互作用复杂性的理解，为相关领域的基础研究和转化应用开辟了新路径。
