《RSC Chemical Biology》：Synthesis of siRNAs containing carbocyclic nucleotides and the role of cyclopentane conformation in RNAi activity
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为了开发更高效的RNAi治疗药物，研究人员针对小干扰RNA（siRNA）反义链5’末端修饰进行了主题研究。他们合成了包含5’-(E)-和5’-(Z)-乙烯基膦酸酯（5'-VP）修饰的碳环DNA（car-DNA）与2’/3’-O-甲基-碳环RNA（car-RNA）的siRNA，并在细胞和小鼠模型中评估了其基因沉默活性。研究结果显示，除3’-O-甲基碳环类似物（VI）外，多数新修饰siRNA的活性均优于无5’磷酸的对照组siRNA，且5’-(Z)-VP-car-DNA（IV）的活性出乎意料地与5’-(E)-VP（I）相当。该研究为siRNA的化学修饰工具箱提供了具有高代谢稳定性的新选择，并为未来设计高效RNAi疗法奠定了基础。
在当今生物医药领域，小干扰RNA（siRNA）作为一类革命性的治疗工具，能够通过RNA干扰（RNAi）通路特异性地沉默致病基因。然而，要将siRNA成功转化为临床应用，必须克服其在体内代谢不稳定、难以高效递送到靶细胞等重大挑战。化学修饰是解决这些问题的关键。在siRNA的作用机制中，其反义链必须被5’端磷酸化，才能被装载到包含Ago2（Argonaute 2）蛋白的RNA诱导沉默复合体（RISC）中，进而切割靶信使RNA（mRNA）。当合成siRNA的反义链5’末端是未经修饰的羟基时，体内磷酸化和随后被酸性磷酸酶快速去磷酸化的过程会严重影响其效能。为了绕过这个瓶颈，一种代谢稳定的磷酸类似物——5’-(E)-乙烯基膦酸酯（5’-(E)-VP）被引入作为5’端修饰，它能显著增强RISC的装载效率和siRNA的效力。有趣的是，其异构体5’-(Z)-VP则被证明无效，这提示了化学结构的微小差异可能导致巨大的生物学功能差异。与此同时，碳环RNA（car-RNA）作为一种非天然核酸，其糖环上的4’-氧原子被亚甲基取代，不仅能保持双螺旋结构，还因2’-羟基的pKa（酸解离常数）更高、亲核性更低而具有更强的核酸酶抗性，显示出作为稳定修饰元件的潜力。为了进一步扩展siRNA的化学修饰工具箱，研究人员提出了一个核心问题：能否将碳环核苷酸的稳定性优势与5’-VP的磷酸模拟功能相结合，开发出兼具高效力与高代谢稳定性的新型siRNA？发表在《RSC Chemical Biology》上的这项研究，正是对这一问题的深入探索。
为开展这项研究，作者主要运用了以下几项关键技术方法：1）有机合成化学方法，合成了包括5’-(E)-VP-car-DNA、5’-(Z)-VP-car-DNA、5’-(E)-VP-2’-O-甲基-car-RNA和5’-(E)-VP-3’-O-甲基-car-RNA在内的四种新型碳环核苷酸磷酰胺单体。2）标准的固相寡核苷酸自动合成技术，将合成的单体整合到靶向小鼠Ttr（转甲状腺素蛋白）和ApoB（载脂蛋白B）mRNA的siRNA反义链5’末端，并合成了多条对照与测试siRNA序列。3）体外功能验证，在取自小鼠的原代肝细胞中，通过自由摄取（free uptake）模型评估了siRNA的基因沉默活性。4）体内药效学评估，通过皮下注射给药小鼠，测定血清中TTR蛋白水平随时间的变化。5）计算建模，使用UCSF Chimera软件，基于Ago2与miRNA的复合物晶体结构，模拟了不同修饰的5’-核苷酸在Ago2 MID（中间）结构域结合口袋中的构象。
研究结果
siRNA的设计与合成
研究人员设计并合成了一系列靶向小鼠Ttr和ApoB基因的siRNA。如表1所示，这些siRNA的反义链5’末端被分别修饰为以下几种结构：无修饰、5’-(E)-VP（I）、5’-(E)-VP-car-DNA（III）、5’-(Z)-VP-car-DNA（IV）、5’-(E)-VP-2’-O-甲基-car-RNA（V）以及5’-(E)-VP-3’-O-甲基-car-RNA（VI）。正义链的3’端则缀合了用于肝脏靶向的三触角N-乙酰半乳糖胺（GalNAc）。所有siRNA链体还进行了标准的化学修饰，如掺入2’-氟-RNA、2’-O-甲基-RNA和硫代磷酸酯骨架连接，以提高稳定性和递送效率。
新型5’-VP-碳环核苷酸修饰siRNA的体外活性
在体外实验中，研究人员评估了这些siRNA在原代小鼠肝细胞中沉默Ttr和ApoB基因的能力。结果显示，在较低的测试剂量下（1 nM用于Ttr靶向，20 nM用于ApoB靶向），携带5’-(E)-VP（I）的对照siRNA（si-2和si-10）比无5’磷酸类似物的对照siRNA（si-1和si-9）效力更强。重要的是，携带5’-(E)-VP-2’-OMe-car-RNA（V）和5’-(E)-VP-car-DNA（III）修饰的siRNA（si-7/si-12和si-3/si-11）的效力与携带5’-(E)-VP（I）的对照siRNA相当。一个出人意料的结果是，携带5’-(Z)-VP-car-DNA（IV）修饰的siRNA（si-5和si-6）表现出了与5’-(E)-VP修饰对照siRNA（si-2）相当的活性。这与先前报道中认为5’-(Z)-VP修饰（II）完全无活性的结论形成了对比。此外，在反义链5’末端第一个和第二个核苷酸之间有无硫代磷酸酯连接，对5’-(E)-VP-car-DNA（III）修饰siRNA的活性没有影响。与此形成鲜明对比的是，携带5’-(E)-VP-3’-OMe-car-RNA（VI）修饰的siRNA（si-8和si-13）的活性甚至比无5’磷酸的对照siRNA还要低。
新型5’-VP-碳环核苷酸修饰siRNA的体内活性
研究人员在小鼠体内进一步验证了部分siRNA的效力。小鼠皮下注射0.4 mg kg-1的siRNA后，监测血清中转甲状腺素蛋白（TTR）的水平。结果显示，修饰了5’-(E)-VP-car-DNA（III）的si-3和修饰了5’-(E)-VP-2’-OMe-car-RNA（V）的si-7，其效力与携带5’-(E)-VP（I）的si-2相当，并且都优于无5’磷酸修饰的对照si-1。这一结果与体外数据一致，再次证实了这些修饰的有效性。同时，携带5’-(E)-VP-3’-OMe-car-RNA（VI）修饰的si-8，其效力低于所有对照siRNA，进一步确认了3’-O-甲基的引入对该修饰的结构和功能产生了负面影响。
计算建模揭示构效关系
为了从结构层面理解这些新型修饰的活性差异，研究人员进行了计算建模研究。他们以Ago2蛋白与5’端为UMP的miR-20a的复合物晶体结构为参考，模拟了不同修饰的5’-核苷酸在Ago2 MID结构域结合口袋中的构象。建模结果显示，5’-(E)-VP-car-DNA（III）和5’-(Z)-VP-car-DNA（IV）的糖环构象分别为C2’-endo和C3’-exo，都能很好地适应MID结构域的结合位点，与晶体结构中的5’ UMP构象非常相似。5’-(E)-VP-2’-OMe-car-RNA（V）也采取了C2’-endo糖折叠构象，与Ago2的结合模式类似于之前报道的5’-(E)-VP修饰结构。然而，活性较差的5’-(E)-VP-3’-OMe-car-RNA（VI）则无法很好地容纳在MID结构域的结合口袋中。其分子与周围的磷酸基团存在短距离接触，并且与反义链上第二个核苷酸的C5’原子距离过近。此外，其碱基与Ago2蛋白Y529残基之间的有利堆积相互作用也被破坏，这可能是其活性低下的结构基础。
研究结论与讨论
本研究成功合成了四种5’-乙烯基膦酸酯（VP）修饰的碳环核苷酸磷酰胺单体，并将其整合到siRNA反义链的5’末端。在细胞和小鼠模型中的系统评估表明，除了5’-(E)-VP-3’-O-甲基-碳环RNA（VI）外，其余新修饰的siRNA（包括5’-(E)-VP-碳环DNA（III）、5’-(Z)-VP-碳环DNA（IV）和5’-(E)-VP-2’-O-甲基-碳环RNA（V））均展现出与经典的5’-(E)-VP修饰siRNA相当、甚至在某些情况下更优的基因沉默活性，其效力均显著优于无反义链5’末端修饰的siRNA。尤其值得注意的是，5’-(Z)-VP-碳环DNA（IV）表现出与(E)-异构体相当的活性，这与先前报道的5’-(Z)-VP在标准核糖骨架上的无活性形成了鲜明对比，揭示了碳环骨架可能改变了分子在Ago2结合口袋中的适应性，从而赋予了(Z)-异构体新的功能。计算建模结果支持了这些发现，活性较高的修饰物（III、IV、V）都能很好地适配Ago2 MID结构域，而活性较差的VI则存在空间位阻冲突。
这项研究的意义重大。首先，它成功地将碳环核苷酸固有的高代谢稳定性与5’-VP的磷酸模拟功能相结合，为siRNA的化学修饰工具箱增添了有价值的新成员。其次，它揭示了核苷酸骨架的微小改变（如用亚甲基替换氧原子形成碳环）可以极大地影响修饰基团的构象偏好和生物学活性，这为理性设计siRNA修饰提供了新的结构见解。最后，所开发出的具有高效力和潜在高稳定性的新型siRNA，为开发下一代更安全、更持久的RNA干扰（RNAi）疗法开辟了新的路径。
