《VIEW》：Immune escape mechanisms revealed by multifunctional nanoprobes targeting PD-L1 in hepatic cancer progression
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为了解决在肝硬化和肝细胞癌(HCC)进展过程中，如何实时、无创地监测关键的PD-1/PD-L1免疫检查点活动这一难题，研究人员开展了一项主题为多功能仿生纳米探针的研究。他们将靶向PD-L1的核酸适配体(PA9-1-Apt)与吲哚菁绿/BMS-684聚合物缀合，构建了ICGB@Apt纳米探针。该探针在CCl4诱导的小鼠模型中，成功实现了对肿瘤组织中PD-L1的动态可视化成像，并有效抑制了疾病进展。其意义在于，该平台为HCC的早期检测和免疫治疗指导提供了一种具有转化潜力的新策略。
肝脏是人体的“化工厂”，默默承担着代谢、解毒等重要职责。然而，一种名为肝细胞癌(HCC)的恶性肿瘤，正严重威胁着全球健康。尤其棘手的是，HCC常常在肝硬化的基础上悄然发生。在这个过程中，肿瘤细胞会狡猾地利用一种名为“免疫检查点”的机制，来逃避免疫系统的监视和攻击，其中，由肿瘤细胞表达的PD-L1(程序性死亡-配体1)与免疫细胞表面的PD-1(程序性死亡-1)结合，是导致免疫抑制的关键通路。尽管靶向PD-1/PD-L1的免疫检查点抑制剂已在临床上应用，但如何实时、无创地监测PD-L1在体内的动态表达，从而精准评估疾病进展和免疫逃逸状态，一直是巨大的技术挑战。传统的检测方法，如免疫组化和流式细胞术，通常具有侵入性且无法实现实时监测。为了突破这一瓶颈，研究人员在《VIEW》期刊上发表了一项创新研究，他们开发了一种能够同时“看清”并“对抗”PD-L1的多功能纳米探针，为肝癌的诊疗带来了新希望。
为了开展这项研究，研究人员综合运用了几项关键技术方法。在生物信息学分析方面，他们整合了来自GEO数据库的多个肝硬化与HCC转录组数据集，利用CIBERSORT算法分析免疫细胞浸润，并通过弹性网络(ElasticNet)模型筛选关键免疫细胞类型。在分子工具构建上，他们采用改进的Cell-SELEX(通过指数富集的配体系统进化)技术，从单链DNA文库中筛选出能特异性靶向HCC细胞表面PD-L1的高亲和力核酸适配体(文中最终选用PA9-1)。在疾病模型方面，他们通过口服CCl4成功构建了小鼠从肝硬化到HCC进展的体内模型，并建立了包含CD8+T细胞、肝硬化细胞和HCC细胞的三维(3D)共培养球体模型进行体外验证。在纳米探针合成与表征上，他们通过EDC-NHS(1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺/N-羟基琥珀酰亚胺)偶联反应，将筛选出的适配体与吲哚菁绿(ICG)和BMS-684聚合物缀合，构建了名为ICGB@Apt的仿生纳米探针，并利用动态光散射(DLS)、透射电镜(TEM)等技术对其理化性质进行了表征。在分析技术层面，研究采用了RNA测序(RNA-seq)分析差异基因表达，并利用流式细胞术(FCM)、酶联免疫吸附试验(ELISA)、免疫荧光(IF)和体内近红外(NIR)荧光成像等多种技术评估探针的靶向性、治疗效果及免疫调节功能。
3.1 利用多个GEO转录组数据集分析肝硬化向HCC进展过程中的免疫浸润
研究人员整合分析了四个GEO数据集，通过CIBERSORT算法和弹性网络模型分析发现，在从肝硬化向HCC转变的过程中，CD8+T细胞、滤泡辅助性T细胞和M0巨噬细胞是发生显著变化的关键免疫细胞类型。这提示这些细胞可能在免疫微环境重塑和疾病进展中扮演重要角色。
3.2 在肝硬化向HCC进展的小鼠肝脏中，CD8+T细胞上PD-1表达发生显著变化
通过构建CCl4诱导的小鼠肝硬化-HCC进展模型，研究人员证实了模型的有效性。对模型小鼠肝脏中分离的CD8+T细胞进行RNA-seq分析，并结合多种机器学习算法(如LASSO、随机森林)筛选，最终确定PD-1 (Pdcd1) 是此过程中与疾病进展相关的关键基因。
3.3 PD-1/PD-L1免疫检查点在肝硬化向HCC进展的免疫逃逸中的作用
通过在小鼠模型中使用短发卡RNA(shRNA)敲低PD-L1的表达，研究发现敲低PD-L1能显著改善肝功能、减轻肝脏纤维化和肿瘤负荷，并增强CD8+T细胞产生干扰素-γ (IFN-γ) 和颗粒酶B (GZMB) 的能力。这直接证明了PD-1/PD-L1轴是驱动肝硬化向HCC进展过程中免疫逃逸的核心机制。
3.4 利用Cell-SELEX技术筛选靶向HCC细胞PD-L1的核酸适配体
研究人员采用Cell-SELEX技术，成功从文库中筛选出能特异性结合HCC细胞(如Hepa1-6)的核酸适配体。其中，适配体PA9-1显示出对PD-L1蛋白的高结合亲和力和对PD-1/PD-L1相互作用的强抑制能力，被确定为后续构建靶向探针的理想分子。
3.5 成功构建核酸适配体修饰的多功能仿生纳米探针ICGB@Apt
通过EDC-NHS化学，将PA9-1适配体与由吲哚菁绿(ICG)和PD-1/PD-L1通路间接抑制剂BMS-684共聚形成的ICGB聚合物缀合，成功合成了ICGB@Apt纳米探针。表征结果显示探针粒径均一，并能在体外实验中特异性结合HCC细胞。
3.6 ICGB@Apt纳米探针抑制肝硬化进展
体外功能实验表明，ICGB@Apt处理能显著提高CD8+T细胞的活性(MTT实验)及其产生GZMB的能力(免疫荧光)。在3D共培养球体模型中，该探针能促进CD8+T细胞浸润，减少纤维化标志物α-SMA的表达，并上调上皮标志物E-钙黏蛋白(E-cadherin)、下调间质标志物N-钙黏蛋白(N-cadherin)和波形蛋白(Vimentin)，表明其可抑制上皮-间质转化(EMT)。此外，探针还能有效杀死HCC细胞并抑制其侵袭能力。
3.7 ICGB@Apt纳米探针监测并抑制肝硬化进展和HCC免疫逃逸
体内实验证明，ICGB@Apt纳米探针能特异性富集于小鼠肿瘤部位，实现长时间的近红外荧光成像，动态监测肝硬化向HCC的转变。治疗上，该探针能改善肝功能、减轻肝纤维化和肿瘤负担。更重要的是，它还能追踪到淋巴结和肺部的转移灶。机制上，探针治疗增加了肿瘤微环境中IFN-γ+和GZMB+CD8+T细胞的比例，且未对主要器官造成明显损伤，显示出良好的生物相容性。
本研究成功构建并验证了ICGB@Apt这一靶向PD-L1的多功能仿生纳米探针。它不仅能够通过近红外成像实时、无创地动态监测肝硬化向HCC进展过程中PD-L1的表达变化，揭示了PD-L1在免疫逃逸中的核心作用，还能通过阻断PD-1/PD-L1通路和抑制EMT过程，有效激活抗肿瘤免疫、减缓纤维化并抑制肿瘤生长与转移。这项研究的结论强调了将诊断与治疗功能整合于单一纳米平台的巨大潜力。ICGB@Apt为代表的技术，克服了传统检测方法的局限，为实现肝癌的早期精准诊断、疗效实时评估以及个性化免疫治疗提供了强有力的新型工具。尽管从实验室走向临床还需解决长期安全性与规模化生产等挑战，但这项研究无疑为癌症诊疗领域开辟了一条富有前景的新路径。
