博韦里辛（Beauvericin）调节家蚕（Bombyx mori）的免疫反应：来自细胞和转录组分析的见解

《Journal of Invertebrate Pathology》：Beauvericin modulates immune responses in the silkworm, Bombyx mori: insights from cellular and transcriptomic analyses

本研究系统评估了白粉菌素（BEA）对家蚕免疫反应的影响，通过血细胞计数、吞噬作用等表型分析和RNA测序发现，BEA以5.23 μM为半数致死浓度，虽抑制血细胞活性却诱导免疫超激活，通过增强吞噬、结痂、黑色素化等反应最终致死幼虫，揭示了其通过干扰Toll、Imd及MAPK信号通路的中毒机制。

　　

Jinhua Fan|Yong Bi|Jia Li|Hui Su|Aiying Cheng|Baozhen Li

山西农业大学林学院，中国太原030031

摘要

尽管已经充分证明了beauvericin（BEA）的细胞毒性作用，但其与昆虫免疫系统的具体相互作用仍缺乏深入研究。本研究系统地探讨了BEA对家蚕（Bombyx mori）免疫反应的影响。通过将幼虫暴露于BEA（0.5–10 μM）中，确定了LC₅₀值，并评估了关键的免疫反应：血细胞计数、存活率、吞噬作用、结节形成、包裹作用以及酚氧化酶（PO）活性，同时利用RNA-Seq进行了转录组分析。结果显示，BEA在家蚕幼虫中的LC₅₀值为5.23 μM。虽然BEA抑制了血细胞的存活率，但却诱导了一种过度活跃的免疫状态。这种状态表现为总血细胞计数的动态双相变化、粒细胞数量显著增加，以及吞噬作用、结节形成（结节最大可达119 μm × 41 μm）、包裹作用和酚氧化酶活性的增强，这些效应在12小时时达到峰值。转录组分析发现722个差异表达基因，表明Toll、Imd和MAPK信号通路以及解毒通路受到了干扰。我们得出结论，BEA引发的免疫过度活跃，尤其是过度的黑色素生成反应，最终导致了幼虫死亡。这些发现为理解BEA的免疫毒性提供了理论基础，并揭示了一种通过免疫过度激活发挥致病性的新机制，从而扩展了我们对真菌毒素生物学和昆虫免疫学的认识。

引言

尽管昆虫具有显著的多样性和进化优势，但仍有许多物种对农业和林业构成严重威胁（Li和Wu，2024）。虽然化学农药被广泛用于防治这些害虫，但其使用引发了环境污染、抗性进化以及对人类健康的潜在风险等问题（Li等人，2025）。作为替代方案，昆虫病原微生物为生物控制提供了有前景的途径（Jordan等人，2021）。其中，Beauveria bassiana真菌是应用最广泛的病原体之一（Fernandez等人，2023）。然而，其广泛应用受到疗效不稳定和杀虫效果较慢的限制，而昆虫的免疫反应是影响其效果的重要因素（Wang等人，2023）。

当昆虫受到感染时，会启动复杂的先天免疫防御机制，包括细胞免疫和体液免疫成分（Ghani等人，2025）。细胞免疫涉及直接的血细胞介导的反应，如吞噬作用、结节形成和包裹外来入侵者（Lavine和Strand，2002；Timofeev等人，2025）。相比之下，体液免疫涉及抗菌肽、溶菌酶等效应分子的系统性产生以及酚氧化酶（PO）级联反应的激活，最终导致黑色素生成（Muhammad等人，2024）。调节这些防御机制的关键是保守的信号通路，尤其是主要对革兰氏阳性细菌和真菌敏感的Toll通路，以及由革兰氏阴性细菌激活的Imd通路（Ma等人，2023）。这种免疫系统的复杂性和高效性体现在不同的转录反应中；例如，家蚕幼虫感染Bacillus subtilis后，一个小时内就会触发快速的基因上调，而感染Beauveria bassiana后，只有三个基因在感染后12小时显著上调（Jin等人，2023）。

昆虫病原真菌克服宿主防御的关键策略之一是产生次级代谢产物毒素（Zhang等人，2020）。Beauveria bassiana分泌多种此类化合物，包括beauvericin（BEA）、Oosporein和Tenellin（Baldiviezo等人，2020；Wang等人，2021）。BEA是一种属于enniatin家族的环己六肽，作为离子载体破坏膜上的离子梯度（如K⁺、Ca²⁺），导致离子稳态失衡、线粒体功能障碍，最终引发细胞凋亡（Wang和Xu，2012；Hasuda和Bracarense，2024）。这种细胞毒性机制在多种系统中得到了验证，包括昆虫细胞系（Gupta等人，1991；Fornelli等人，2004）、哺乳动物细胞（Patra等人，2024；Prosperini等人，2013；Schoevers等人，2016；S?derstr?m等人，2022）以及其他模型（Büchter等人，2020；Katerina等人，2005；Mallebrera等人，2018），并且已知涉及MAPK等通路的激活（Lee等人，2018）。因此，BEA被认为是产生它的真菌的主要毒力因子。

尽管已经明确了BEA的总体毒性，但其与昆虫免疫系统的具体相互作用及其调节机制仍不甚清楚。目前的普遍观点认为，免疫抑制只是其广泛细胞毒性的一个下游后果（Hanson等人，2020）。然而，关于BEA是否直接且特异性地操纵免疫通路，仍存在重要的知识空白。目前缺乏将表型免疫反应与潜在的转录变化相结合的全面研究。

为填补这一空白，我们使用了家蚕（B. mori）这一成熟的鳞翅目模型，系统地评估了BEA的免疫调节作用。我们假设BEA诱导了一种复杂且失调的免疫状态，这对其杀虫效果至关重要，超出了简单的细胞毒性模型。我们的具体目标是：（1）确定BEA的剂量依赖性致死剂量（LC₅₀）；（2）分析其对关键细胞（血细胞计数、存活率、吞噬作用、结节形成）和体液（PO活性）免疫参数的时间影响；（3）通过RNA-Seq分析阐明全局转录变化，特别是与免疫相关的通路。通过结合表型测定和转录组学研究，本研究旨在揭示BEA诱导的免疫毒性的新机制，从而更深入地理解其在真菌致病性中的作用及其潜在应用。

实验部分

昆虫与BEA

Bombyx mori（Nistari品系）来自中国农业科学院国家遗传资源保存中心。所有实验均使用第五龄期第三天的健康幼虫。家蚕在光照培养箱（GDN-300E-4，宁波Ledian仪器制造有限公司）中饲养，温度为26 ± 1°C，相对湿度为85%，光照周期为12小时光照：12小时黑暗，并以新鲜桑叶为食。

Beauvericin（BEA，M = 783.95 g/mol，HPLC纯度≥97%）

BEA对家蚕的毒力

BEA对家蚕表现出浓度依赖性的致死效应，表现为随着浓度的增加，中位致死时间（LT₅₀）逐渐缩短。在0.5、1、2.5、5和10 μM BEA浓度下，校正后的死亡率分别为40.00%、35.00%、36.67%、50.00%和70.00%，相应的LT₅₀值分别为3.06天、3.84天、3.20天、2.74天和2.15天。中位致死浓度（LC₅₀）确定为5.23 μM（表1）。接受BEA处理的家蚕最终死亡

讨论

本研究全面分析了BEA对家蚕（B. mori）的免疫调节作用，结合了表型免疫测定和转录组分析来探讨其杀虫活性的机制基础。我们的研究结果表明，BEA对细胞免疫和体液免疫反应产生了复杂的多方面影响，最终导致免疫过度激活。本研究的关键在于其综合实验方法，该方法结合了...

CRediT作者贡献声明

Jinhua Fan：撰写——审稿与编辑、监督、项目管理、资金获取、数据管理、概念构思。Yong Bi：撰写——初稿撰写、方法设计、实验实施、数据管理、概念构思。Jia Li：数据可视化、结果验证。Hui Su：数据可视化、结果验证。Aiying Cheng：数据可视化、结果验证。Baozhen Li：撰写——审稿与编辑、资金获取、正式数据分析、数据管理、概念构思。

利益冲突声明

作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文的研究结果。

致谢

我们感谢所有参与本研究的人员。