《Advanced Science》：Cells Dynamically Adapt Their Nuclear Volumes and Proliferation Rates During Single to Multicellular Transitions
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本研究聚焦于肿瘤等致密多细胞环境中细胞如何动态调控其体积与力学性质这一关键问题。研究人员通过构建可调控的3D生物混合聚合物水凝胶模型，探索了癌细胞在形成多细胞球体过程中的细胞与细胞核体积、细胞周期及细胞力学的变化。结果表明，单细胞向多细胞结构转化导致细胞及细胞核体积显著减小、细胞周期延迟（G1期细胞积累）及细胞质量密度/硬度增加，而这些变化相互耦联。该发现揭示了细胞在多细胞状态下对其体积、力学和细胞周期进程的动态调控机制，为理解肿瘤发生、发展及侵袭过程中的生物物理适应提供了新见解。
当我们观察生命的起点，从一个受精卵分裂、生长，最终形成一个复杂的多细胞生物时，细胞体积的变化是这一过程中的基本特征。不仅在发育中，细胞体积在分化、衰老乃至癌症等疾病状态下也发生着显著变化。在肿瘤内部，细胞拥挤地堆积在一起，形成了一个物理性质异常复杂的微环境。长期以来，科学家们已知细胞会根据其状态和功能动态调节自身的体积和力学性质，但在像发育中的肿瘤这样致密的三维多细胞环境中，这些属性是如何被精确调控的，仍是一个未解之谜。尤其是在肿瘤从单细胞生长为多细胞团块，以及最终可能发生侵袭和转移的过程中，细胞自身的大小、内部压力、与周围细胞的相互作用，是如何协调并影响整个肿瘤的生物学行为的？解答这些问题，对于深入理解肿瘤的生长逻辑和寻找新的干预策略至关重要。
为了回答这些问题，一个由研究人员组成的团队在《Advanced Science》杂志上发表了一项研究。他们巧妙地设计了一个体外模型，将单个癌细胞嵌入到一种机械性能可调的、模拟细胞外基质的生物混合聚合物水凝胶中，模拟肿瘤微组织的早期形成过程。通过结合高分辨率成像、图像分割和多种先进的生物物理测量技术，他们系统性地观察并量化了细胞在从“单打独斗”到“抱团”形成多细胞球体过程中的一系列动态变化。研究发现，这一转变并非简单的数量叠加，而是伴随着细胞自身深刻的“重塑”：细胞的“大脑”——细胞核，以及整个细胞的体积都发生了大幅“缩水”；细胞的增殖“时钟”——细胞周期出现了延迟；与此同时，细胞内部的“拥挤”程度和“坚硬”程度也在增加。令人惊讶的是，当细胞从球体中“逃离”出来，准备侵袭周围组织时，这个过程又发生了逆转。这些发现揭示了一种此前未被充分认识的、依赖于细胞“社会状态”（单细胞vs多细胞）的、动态可塑的体积与力学调控程序，为理解肿瘤的异质性、侵袭性以及开发针对肿瘤生物物理特性的疗法提供了全新的视角。
在技术方法上，本研究主要依赖于以下几个关键平台：首先，研究人员使用了可被基质金属蛋白酶(MMP)切割的聚乙二醇(PEG)-肝素生物混合水凝胶体系，其机械刚度（弹性模量）可在1.95 kPa至18.75 kPa范围内精确调控，为细胞生长提供了可控的3D微环境。其次，利用转盘共聚焦显微镜和光片显微镜对活细胞进行高分辨率、长时间尺度的三维成像。第三，通过基于深度学习的图像分割工具（如StarDist, Limeseg）对获取的三维图像堆栈进行自动化的细胞核和整个细胞/球体体积分割与量化。第四，借助光学衍射层析成像技术测量细胞集群的折射率以反映其质量密度，并利用布里渊显微镜绘制细胞/球体的弹性图谱以评估其力学性质（纵向模量）。此外，还使用了荧光泛素化细胞周期指示剂(FUCCI)报告系统来实时监测和区分处于不同细胞周期阶段的细胞。
研究结果
2.1 在明确的3D环境中从单细胞生长肿瘤球体
研究人员将单个MCF-7乳腺癌细胞嵌入MMP可切割的PEG-肝素水凝胶中培养。通过共聚焦显微镜观察，在第1天以单细胞为主，第4天形成约4-30个细胞的小簇，第14天则形成了直径约100-160 μm、包含超过200个细胞的大型球体。这些由单细胞克隆增殖而来的多细胞结构在组织形态上类似于患者来源的导管原位癌样本。
2.2 与单细胞相比，球体中的细胞核体积减小
通过活细胞成像和3D分割量化发现，在形成多细胞结构的过程中，细胞核体积显著下降。例如，MCF-7细胞的平均细胞核体积在第4天减少了约40%，在第14天减少了约60%。类似的趋势在胰腺癌细胞(PANC1)和非癌性乳腺上皮细胞(MCF10A)中也得到证实。间接计算的平均细胞体积在球体中也明显降低。这种体积减小也出现在通过细胞聚集形成的悬浮球体中，且与起始细胞数量无关，表明是多细胞状态本身而非增殖次数导致了体积变化。追踪实验证实，单个母细胞的细胞核体积总是大于其第4天后代的平均细胞核体积。
2.3 细胞核体积减小与机械限制无关
通过改变水凝胶的刚度和可降解性来调节球体所承受的生长诱导压缩应力（0至约2.5 kPa），发现尽管球体生长受到抑制，但其内部细胞的细胞核体积在不同机械条件下没有显著差异。抑制机械敏感性离子通道也对体积变化无影响。这表明观察到的细胞核体积减小并非由多细胞结构内部的机械压迫直接导致。
2.4 与单细胞相比，球体中G1期细胞比例增加
使用FUCCI细胞周期报告系统发现，在第1天，大多数单细胞处于S/G2期，而在第4天形成的小簇中，处于G1期的细胞比例显著增加。定量分析显示，G1期细胞的细胞核体积显著小于S/G2期细胞。这种G1期细胞积累的现象在HeLa细胞、从凝胶中释放的细胞以及悬浮聚集的球体中也存在。RNA测序数据也显示了细胞周期相关基因集的变化。
2.5 细胞周期分布的变化部分解释了细胞核体积的减小
通过光片显微镜时间序列成像测量细胞周期时长发现，在培养后期（第8-10天），细胞的G1期时长显著延长（从约10小时延长至至少23小时），而S/G2期时长变化相对较小。为了探究细胞周期分布变化对总体积的影响，研究人员用CDK1抑制剂RO-3306处理细胞簇，将细胞阻滞在S/G2期。这导致细胞簇中S/G2细胞比例增加，并部分逆转了细胞核体积的减小。一个简单的理论模型模拟也支持细胞周期延长（特别是G1期）导致的G1期细胞积累，可以解释群体平均细胞体积的逐渐降低。
2.6 从球体中释放细胞导致细胞肿胀
比较细胞在凝胶原位状态和从球体中酶解释放成单细胞后的细胞核体积，发现第1天无明显差异，但在第4天和第14天，释放后的细胞其细胞核体积相较于原位状态分别显著增加了约46%和95%。这表明细胞在多细胞环境下维持了较小的体积，脱离该环境后能快速“膨胀”。尽管有肿胀，释放后的细胞在不同培养时间点之间，其细胞核和细胞体积仍存在显著差异，这被认为是由于上述细胞周期分布的不同所致。
2.7 球体内的细胞增加其细胞质密度并降低可压缩性
通过光学衍射层析成像测量，发现第4天细胞簇的平均折射率显著高于第1天的单细胞，表明其质量密度（单位体积干质量）更高。利用布里渊显微镜进一步发现，随着结构增大（从单细胞到小簇再到球体），布里渊频移显著增加，意味着细胞的纵向模量（与不可压缩性相关）提高。这些变化与细胞周期无关，提示细胞在多细胞结构内可能通过调节细胞内含水量，使其原生质更加“拥挤”，从而导致体积减小、密度和硬度增加。RNA测序也发现了多种离子通道和泵的差异表达。
2.8 侵袭的单个细胞具有增大的细胞核体积
在一个诱导侵袭的肿瘤模型（MCF10A-ER-Src细胞激活Src后）中，研究人员发现，从球体中侵袭出来的细胞，其细胞核体积显著大于仍留在球体核心的细胞。同时，在PANC1侵袭球体的边缘，细胞的布里渊频移低于球体核心区域，表明侵袭细胞更“软”。对患者来源的浸润性导管癌组织切片的分析也显示，位于侵袭前沿的细胞核面积大于肿瘤核心区域，这在一定程度上印证了体外模型的发现。而在导管原位癌样本中，则未观察到从核心到边缘的连续细胞核大小梯度。
研究结论与讨论
这项研究揭示，当单细胞形成多细胞结构时，会发生剧烈的细胞和细胞核体积减小。作者提出这一现象由两个潜在关联的机制导致：一是细胞周期分布的变化，即随着时间推移，更小的G1期细胞逐渐富集；二是与细胞内相对含水量减少相关的细胞体积减小，这导致了细胞质量密度和整体硬度的增加。这一过程是动态可塑的，当细胞从多细胞球体中脱离并侵袭时，体积减小的趋势会发生逆转，表现为细胞核体积增大和细胞软化。
该发现具有多重意义。首先，它揭示了细胞体积、细胞周期进程和细胞力学特性在多细胞状态下存在一种紧密的耦合与动态调控，这种调控超越了单纯的机械压迫效应。其次，研究挑战了关于肿瘤球体内存在由静水压力驱动的、从核心到边缘的连续细胞体积梯度的观点，而是强调了细胞体积调控可能更依赖于其“多细胞背景”（是否与邻居连接）。当细胞失去细胞间连接时，体积调节程序可能发生切换，导致肿胀，这或许是侵袭的一个后果而非原因。第三，更坚硬、更致密的细胞表型可能有助于细胞团在循环等压力环境下存活，而更软、更大的侵袭细胞表型则与已知的侵袭性增强相关。这些生物物理特性的变化可能与肿瘤的进展和转移效率密切相关。最后，该研究提醒使用3D细胞模型（如球体）进行药物筛选或机制研究的研究人员，需要意识到细胞在这些模型中可能经历了显著的体积、细胞周期和力学特性的适应，这些变化可能广泛影响细胞信号传导和基因表达，从而影响实验结果及其与2D培养或体内情况的可比性。总之，这项工作为理解在肿瘤生长和侵袭等过程中，细胞如何根据其多细胞状态动态调整自身物理属性提供了新的框架，这些发现也可能适用于其他生理和病理过程中细胞在单细胞与多细胞状态间的转换。
