《Advanced Science》：Vascularized Cardiac Tissue Engineering: From Advances in Biofabrication to Translational Applications
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这篇综述为心脏组织工程领域提供了一篇深刻的指导性评述。作者超越了传统技术的罗列，开创性地提出了一个以流程为导向的框架，系统解析了如何整合细胞成分、生物材料设计和生物制造策略，以协同调控工程心肌组织中的血管形成、灌注稳定性和心肌功能。文章批判性地评估了在心脏特异性生理限制下，自组装、模具铸造、3D生物打印和微流控等方法各自的优势与权衡，并探讨了血管化心脏组织在疾病建模、药物筛选和再生治疗中的应用前景与当前局限。该文将血管化心脏组织工程重新定义为一项集成的制造挑战，为推进功能性人类心脏模型的构建提供了连贯的概念指引。
引言：构建“有生命”的心脏组织模型
体外构建仿生的血管化心脏组织，是心血管研究领域一个充满前景与挑战的新兴课题。相比于传统的单层细胞培养或动物模型，工程化的心脏组织能够提供更贴近人体、可控的微环境，从而实现对心肌生理和病理过程的精确研究。其在疾病建模、药物筛选以及再生疗法（如心肌梗死修复）方面展现出巨大的转化潜力。然而，心脏是一个高耗能的器官，天然心肌组织依赖于高度特化的、层次分明的血管网络来维持持续的氧和营养供应。在工程化的心脏组织中，尤其是在较厚或临床规模的构建体中，如果未能复现这种复杂的血管结构，将导致养分扩散受限、电机械功能受损以及生理相关性降低。因此，如何在体外构建具有可灌注血管系统的人类相关心脏组织，始终是该领域的核心研究焦点和悬而未决的挑战。
这篇综述旨在提供一个以流程为导向的框架，来理解血管化心脏组织工程。它系统性地分析了细胞组分、生物材料设计和生物制造策略如何共同决定血管形成、灌注稳定性和心肌功能，并最终将其视为一个集成的制造挑战，而非孤立技术的简单集合。
心脏组织工程的细胞基石
构建血管化心脏组织，首先需要理解其复杂的细胞组成。心脏组织主要由源自中胚层的细胞构成，包括心肌细胞(CMs)、内皮细胞(ECs)、心脏成纤维细胞(FBs)、壁细胞（周细胞和平滑肌细胞(SMCs)）以及免疫细胞。尽管心肌细胞占据了哺乳动物心脏约70-85%的体积，但单细胞转录组分析显示，在细胞数量上占主导地位的实际上是基质和血管细胞。这种独特的分布，突出了在工程心脏组织中整合多种确定细胞类型以复现天然细胞结构的重要性。
心肌细胞是心脏收缩的主要驱动力，是构建工程心脏组织的基石。然而，成年哺乳动物的CMs是终末分化的，再生能力有限。人类多能干细胞(hPSCs)，特别是人诱导多能干细胞(hiPSCs)的发现，为心脏组织工程提供了可再生的CMs来源。通过模拟胚胎心脏发育，科学家们已能高效地在二维(2D)分化系统中产生包括心室、心房和起搏器细胞在内的多种CMs亚型。此外，心血管祖细胞(CVPCs)作为一种多能祖细胞，能够同时分化为心肌细胞和血管细胞，为同时贡献于心肌和血管区室提供了另一种策略。
血管重建的关键角色
与大多数器官相比，心脏的微血管系统拥有异常高的毛细血管密度，以满足其巨大的代谢需求。成功的血管工程需要多种血管细胞群的协调贡献。内皮细胞具有在三维水凝胶或细胞外基质中自组装成管状网络的内在能力。在工程心脏组织中，与内皮细胞共培养不仅能改善组织血管化，还能通过旁分泌信号增强CMs的成熟。然而，仅由内皮细胞构成的血管往往不稳定。血管壁细胞，特别是周细胞和平滑肌细胞，对于微血管和小直径血管的结构支持、成熟和收缩调节至关重要。将内皮细胞与周细胞在基于纤维蛋白的水凝胶中共培养，可促进形成稳定、有管腔的微血管系统。
除了这些分化的细胞，血管祖细胞，如内皮祖细胞，为构建血管化心脏组织提供了另一种有前景的细胞来源。这些细胞可以增殖并自组织成有分支的管状结构。将源自hiPSCs的CD34+内皮/血管细胞与CMs结合，可在心脏球状体和3D生物打印的心脏补片中形成微血管网络。
不可或缺的基质细胞
基质细胞群体，包括心脏成纤维细胞、免疫细胞和间充质干细胞(MSCs)，在调节心肌稳态、血管发育和组织整合中扮演着重要角色。心脏成纤维细胞约占人心室心肌细胞数量的15.5%，是细胞外基质(ECM)合成和重塑的关键调节者。在工程心脏组织中，成纤维细胞通过旁分泌信号和ECM沉积，有助于血管稳定和组织成熟。与CMs和ECs共培养时，心脏成纤维细胞可促进CMs排列和电生理成熟。
免疫细胞，特别是常驻巨噬细胞和调节性T细胞(Tregs)，已被证明是血管发育和组织重塑的关键贡献者。将源自hPSCs的原始巨噬细胞整合到微血管化心脏组织中，可显著影响其功能和灌注性。间充质干细胞则因其广泛的可用性、易于分离和低免疫原性而受到再生医学的青睐，它们可通过分泌旁分泌因子来促进内皮分化和血管形成。
构建血管支架的生物材料
选择合适的生物材料来搭建细胞生长和血管形成的支架，是组织工程成功的关键。天然蛋白基材料因其良好的生物相容性和生物活性而被广泛应用。
I型胶原是天然细胞外基质中最普遍和用途最广的生物材料之一。其分子结构中的特定基序可与内皮细胞表面的整合素结合，支持内皮细胞形态发生和血管组装。在动态平台如器官芯片和3D生物打印中，胶原能支持在可灌注或机械活性条件下的多尺度血管组织。
纤维蛋白是血凝块的主要结构成分，因其多孔和纳米纤维结构为细胞粘附和迁移提供了基质。其机械性能可通过调整纤维蛋白原与凝血酶的比例来调节。纤维蛋白可作为促血管生成生长因子（如VEGF和bFGF）的储存库，从而增强内皮增殖和血管形态发生。在微流体系统中，将内皮细胞与心脏类器官在基于纤维蛋白的基质中共培养，可形成互连的血管网络。
脱细胞细胞外基质(dECM)通过去除天然组织的细胞成分，同时保留组织特异性的生化信号，成为一种有吸引力的方法。心脏来源的dECM为工程化血管心脏组织提供了最直接的器官特异性微环境，可促进心脏祖细胞成熟和血管网络形成。大网膜则是另一个有价值的dECM来源，其高血管密度和相对易获取性，使其在构建个性化血管化组织方面潜力巨大。
明胶作为胶原的变性衍生物，保留了细胞粘附的RGD基序。通过化学修饰获得的甲基丙烯酰化明胶(GelMA)，则可进行光交联，从而提供卓越的结构保真度，并与3D生物打印等先进生物制造技术兼容。
牺牲材料：为血管“塑形”
牺牲成型策略已成为在水凝胶基心脏组织构建体中制造可灌注血管网络的一种强大而通用的方法。其原理是嵌入一个可移除的模板，选择性溶解后形成互连的管腔通道。
热响应材料如明胶，利用其温度依赖的溶胶-凝胶转变特性。通过加热液化预先成型的明胶模板，可在周围基质中创造出血管通道。金属镓(Ga)作为一种新颖的牺牲墨水，在室温下为固体，在37°C时液化，并能完全退出微米级通道而无残留，为创建高分辨率的血管模板提供了可能。
化学或生物敏感材料，如海藻酸钠，可通过二价阳离子（如Ca2+）进行离子交联，并能被螯合剂（如EDTA）或海藻酸裂解酶选择性降解。通过微流控纺丝制造的海藻酸盐纤维嵌入水凝胶后，经酶促牺牲，内皮细胞可快速迁移到生成的通道中并互连，形成早期血管网络。
工程化血管化心脏组织的方法
在构建血管化心脏组织的过程中，涉及多种组织工程方法。三维自组装，特别是通过多细胞聚集形成心脏球状体，为研究细胞相互作用提供了一个直接的策略。与2D共培养相比，3D平台能更好地复现细胞-ECM相互作用、组织结构以及营养/氧气梯度。通过将hiPSCs来源的心肌细胞、内皮细胞和成纤维细胞以特定比例（如70:15:15）共培养，可生成具有预先形成血管网络的微型组织。将源自hiPSCs的血管球体与CMs包裹，则可生成具有内腔血管系统的腔室化心脏类器官。
除了细胞聚集，从头分化是生成自组装心脏类器官的另一条途径。通过模拟早期心脏发育事件，hiPSCs在特定条件下可分化和自组织成包含心肌和血管谱系的结构。将hiPSCs来源的心脏类器官嵌入基质胶中，可诱导形成覆盖有周细胞的微血管样结构。更有研究通过阶段特异性分化条件处理图案化的hPSCs，成功生成了具有空间组织和血管分支的心脏类器官。
模具铸造是另一种广泛使用的技术，通过将细胞-水凝胶混合物浇注到具有特定几何形状的模具中，来制造工程心脏组织。结合牺牲性材料，可以在这些组织中创建可灌注的通道。例如，将载有细胞的可交联基质注入包含牺牲性纤维的模具中，交联后移除牺牲纤维，留下中空的通道，内皮细胞随后可迁移并覆盖通道内壁，形成血管腔。
3D生物打印技术能够以精确的空间控制方式沉积生物墨水（包含细胞和生物材料），为构建复杂的、患者特异性的组织结构开辟了道路。该技术可用于打印包含内皮细胞和心肌细胞的不同生物墨水，直接构建具有预定义血管图案的组织。例如，使用悬浮打印技术，可将载有细胞的胶原生物墨水打印到支持浴中，以创建厘米尺度、具有复杂内部结构（如心脏心室）的构建体。打印后，内皮细胞可自组装成网络，并与心肌细胞整合。
微流控器官芯片技术通过将细胞培养与微尺度的流体控制相结合，能够模拟组织的动态微环境和生理剪切力。该技术特别适合于创建具有可灌注血管网络的血管化心脏组织模型。在芯片上设计相邻的通道，分别种植内皮细胞和包含心肌细胞、成纤维细胞和内皮细胞的混合细胞水凝胶，在灌注培养下，内皮细胞可形成互连的血管网络，并与心肌细胞区域整合，形成具有节奏性收缩的血管化心肌组织。
应用前景与未来方向
血管化心脏组织在疾病建模和药物测试中展现出广阔的应用前景。例如，利用源自患者的hiPSCs构建血管化心脏组织，可以模拟特定遗传性心脏病，并用于测试药物的疗效和心脏毒性。在再生疗法方面，预血管化的心脏补片移植到梗死心脏后，其内部的血管网络有望与宿主血管系统连接，改善血液供应，从而增强移植细胞的存活和心脏功能的恢复。
尽管取得了显著进展，该领域仍面临一些挑战。例如，如何实现工程组织中血管网络的长时期灌注和生理成熟，如何精确控制不同类型细胞的空间排列和相互作用，以及如何将实验室规模的构建体扩大到临床相关的尺寸等。未来的发展方向可能包括开发动态灌注生物反应器来模拟心脏的机械和流体环境，以及建立标准化的功能评估体系来指导下一代血管化心脏组织模型的发展。通过跨学科的共同努力，将工程学、生物学和临床医学相结合，有望加速血管化心脏组织工程从实验室向临床应用的转化。
