淀粉样前体蛋白衍生物会差异性地改变星形胶质细胞来源的细胞外囊泡中所含的微小RNA（microRNA）成分

《Neuroscience》：Amyloid precursor protein derivatives differentially alter the microRNA cargo of astrocyte-derived extracellular vesicles

该研究探讨β淀粉样蛋白前体纤维（AβPF）和分泌型αAPP（sAPPα）对小鼠星形胶质细胞来源的外泌体（ADEVs）miRNA货物的影响。结果显示，AβPF处理显著增加ADEVs中let-7c-5p、miR-29a-3p和miR-34a-5p的表达，而sAPPα处理及其与AβPF联用分别上调miR-99b-5p和miR-181d-5p。生物信息学分析表明，sAPPα+ AβPF组的靶基因富集于免疫相关通路，而AβPF组的靶基因与AD病理相关，提示sAPPα可能通过调节miRNA表达发挥神经保护作用。

　　

艾米·J·朱（Aimee J. Chu）|安娜·埃尔兰德松（Anna Erlandsson）|乔安娜·M·威廉姆斯（Joanna M. Williams）

奥塔哥大学解剖学系，达尼丁 9016，新西兰

摘要

阿尔茨海默病（AD）中细胞外囊泡（EVs）的蛋白质和microRNA成分会发生改变，这可能促进疾病进展。我们之前的研究表明，小鼠和人类星形胶质细胞摄入β-淀粉样蛋白（Aβ）会导致EVs中的蛋白质成分发生变化，从而引起显著的神经元损伤和凋亡。在此，我们假设星形胶质细胞衍生的EVs（ADEVs）中的microRNA成分在暴露于Aβ后也会发生病理变化，而用具有神经保护作用的淀粉样前体蛋白-α（sAPPα）处理星形胶质细胞则会在ADEVs中诱导出microRNA表达的神经保护性变化。我们将原代小鼠星形胶质细胞分别用载体、0.1 μM Aβ原纤维（AβPF）、1 nM sAPPα或1 nM sAPPα与0.1 μM AβPF联合处理（sAPPα + AβPF）。利用高灵敏度的TaqMan Advanced microRNA阵列通过RT-qPCR检测ADEVs中差异表达的microRNA，这些microRNA与168种神经退行性病变相关。暴露于AβPF的星形胶质细胞产生的ADEVs中let-7c-5p、miR-29a-3p和miR-34a-5p的含量显著升高，而sAPPα和sAPPα + AβPF处理的星形胶质细胞产生的ADEVs中miR-99b-5p和miR-181d-5p的含量显著增加。生物信息学分析显示，ADEVs中上调的microRNA的基因靶点主要涉及与AD病理相关的多个通路，sAPPα + AβPF组的基因靶点还涉及免疫系统相关通路。相比之下，miR-99b-5p的基因靶点直接参与AD相关通路，表明sAPPα处理的星形胶质细胞分泌的ADEVs具有神经保护潜力。

引言

星形胶质细胞是大脑中的主要胶质细胞类型，对组织稳态和细胞间通讯至关重要。例如，星形胶质细胞作为三联突触的一部分与突触前和突触后神经元紧密相连（Araque等人，1999年），因此能够调节和优化突触环境（Goenaga等人，2023年；Kofuji和Araque，2021年）。此外，星形胶质细胞与小胶质细胞之间存在大量相互作用，这种相互作用通过多种信号分子介导，使星形胶质细胞能够参与免疫反应，尤其是在中枢神经系统损伤和神经退行性疾病中（Linnerbauer等人，2020年；Matejuk和Ransohoff，2020年）。这种细胞间通讯通过细胞外囊泡（EVs）的分泌和摄取实现，包括外泌体（40–150 nm）和微囊泡（150–1,000 nm）（Doyle和Wang，2019年；Jeppesen等人，2019年）。EVs含有蛋白质、脂质和功能性遗传物质，这些物质被脂质双层保护，但可以在受体细胞中发挥各种病理或保护作用（Valadi等人，2007年；Zhao等人，2021年）。星形胶质细胞功能的丧失以及毒性功能的获得，包括释放含有病理改变成分的ADEVs，可能会加剧阿尔茨海默病（AD）等神经系统疾病的不良过程（Chu和Williams，2022年；Pekny等人，2016年；Sofroniew和Vinters，2010年；Zhao等人，2021年）。

AD是一种进行性神经退行性疾病，其特征是记忆丧失和认知障碍（Hippius和Neund?rfer，2003年）。这些症状通常被认为是由β-淀粉样蛋白（Aβ）肽的有毒可溶性聚集体直接或间接引起的，包括二聚体、寡聚体和原纤维（Furukawa等人，1996年；Goodman和Mattson，1994年；Kadowaki等人，2005年；Keil等人，2004年；Klyubin等人，2012年；Shankar等人，2007年）。星形胶质细胞受到AD病理的严重影响（Nagele等人，2003年；Pike等人，1994年；Singh等人，2020年；Tu等人，2015年；Yang等人，2011年；Zeppenfeld等人，2017年），并进入一种称为反应性星形胶质细胞增生的反应状态（Escartin等人，2021年）。在AD患者的脑中，反应性星形胶质细胞靠近淀粉样斑块（Nagele等人，2003年；Pike等人，1994年），并产生更多的炎症介质，包括促炎细胞因子（Singh等人，2020年）。此外，星形胶质细胞还会响应小胶质细胞在Aβ作用下释放的促炎细胞因子（Combs等人，2001年；Floden等人，2005年；Kim等人，2004年；Lue等人，2001年），从而加剧与AD相关的慢性神经炎症（Newcombe等人，2018年）。有趣的是，Aβ和促炎细胞因子都会改变microRNA（miRNA）的表达，microRNA是一种负调控蛋白质表达的小非编码RNA（Chu和Williams，2022年；Cui等人，2010年；Gebert和MacRae，2019年；Guedes等人，2014年；Huntzinger和Izaurralde，2011年；van Scheppingen等人，2018年；van Scheppingen等人，2016年）。

我们之前的研究表明，小鼠星形胶质细胞以及由人类诱导多能干细胞（iPSC）衍生的星形胶质细胞能够容易地摄取聚集的Aβ，但会储存而不是降解这些物质（Beretta等人，2024年；Konstantinidis等人，2023a；Konstantinidis等人，2023b；Rostami等人，2021年；S?llvander等人，2016年；Zy?k等人，2023年）。相反，摄入的Aβ仅部分降解，导致神经毒性Aβ释放到EVs中的培养基中（Beretta等人，2024年；Beretta等人，2020年；S?llvander等人，2016年）。值得注意的是，含有Aβ的ADEVs被皮质神经元摄取会导致显著的线粒体和突触损伤，进而引发细胞凋亡（Beretta等人，2020年）。我们还发现，暴露于Aβ的培养物分泌的ADEVs中ApoE的水平升高（Nikitidou等人，2017年）。这些研究支持其他研究结果，表明EVs中的蛋白质成分在AD病理过程中会发生失调（Asai等人，2015年；Durur等人，2022年；Goetzl等人，2018年；Goetzl等人，2016年；Goetzl等人，2015年；Rajendran等人，2006年；Winston等人，2019年；Winston等人，2016年），并且这种失调可以从一个细胞传播到另一个细胞（Howitt和Hill，2016年；Wang等人，2017年）。重要的是，EVs还携带mRNA以及成熟的和前体的miRNA，这些miRNA可以调节受体细胞的基因表达并改变其生理功能（Chaudhuri等人，2018年；Chen等人，2010年；Cheng等人，2014年；Gebert和MacRae，2019年；Hu等人，2012年；Jeppesen等人，2019年；Malm等人，2016年；Valadi等人，2007年）。EVs中改变的miRNA成分可以反映AD大脑中的变化，并作为AD的生物标志物。例如，miR-335-5p在AD患者脑组织中下调（Wang等人，2020年），但在从AD患者血浆中分离出的EVs中上调（Cheng等人，2015年），表明miR-335-5p优先被释放到EVs中。此外，最近有研究报道，在携带PSEN1常染色体显性突变的星形胶质细胞分泌的ADEVs中，几种与炎症相关的miRNA的表达减少（Garcia等人，2022年）。因此，了解ADEVs的miRNA成分是否因Aβ病理而改变将有助于阐明星形胶质细胞在AD病理中的作用机制。

与Aβ不同，分泌的淀粉样前体蛋白-α（sAPPα）是另一种淀粉样前体蛋白（APP）的切割产物（Chow等人，2010年），具有神经保护作用。除了增强突触可塑性的功能外（Hick等人，2015年；Livingstone等人，2021年；Mockett等人，2019年；Mockett和Ryan，2023年；Moreno等人，2015年；Morrissey等人，2019b年；Morrissey等人，2019a年；Richter等人，2018年；Tackenberg和Nitsch，2019年；Tan等人，2018年；Taylor等人，2008年；Thornton等人，2006年；Xiong等人，2017年），sAPPα还能保护神经元免受Aβ的毒性（Goodman和Mattson，1994年；Mattson等人，1993年），减少Aβ斑块负荷（Fol等人，2016年），并改善老年野生型和AD转基因小鼠的记忆表现（Fol等人，2016年；Tan等人，2018年；Xiong等人，2017年）。这些作用主要归因于sAPPα调节参与神经保护和突触可塑性的基因网络和蛋白质表达的能力（Livingstone等人，2021年；Mockett等人，2019年；Ryan等人，2021年；2013年）。我们之前发现sAPPα在多个miRNA编码基因的转录调控中起新作用，包括与AD病理相关的miRNA基因（Ryan等人，2021年；Ryan等人，2013年）。尽管sAPPα对星形胶质细胞的影响尚未得到充分研究，但最近的一项研究表明，sAPPα处理可以改变原代小鼠皮质星形胶质细胞的蛋白质组和分泌组（Peppercorn等人，2023年）。目前尚不清楚ADEVs的miRNA成分是否因Aβ或sAPPα而改变。此外，由于sAPPα的神经保护和促进可塑性的特性，它被认为可能是AD的潜在治疗手段，因此了解sAPPα与Aβ共同作用对miRNA表达的影响也很重要。因此，在本研究中，我们从暴露于载体、Aβ原纤维（AβPF）、sAPPα或sAPPα与AβPF联合处理的原代小鼠星形胶质细胞中分离出ADEVs，以评估ADEVs中的miRNA变化。

部分内容摘要

药物和试剂

Aβ₄₂原纤维（AβPF）是在乌普萨拉大学的埃尔兰德松实验室根据先前描述的方法制备的（Beretta等人，2020年；Nikitidou等人，2017年；S?llvander等人，2016年）。简而言之，将合成的未标记Aβ₄₂肽（American Peptide Company Inc.生产）溶解在10 mM NaOH中，与磷酸盐缓冲液（PBS）混合至443 μM（2 mg/mL）的浓度，然后在37°C下孵育30分钟。之后离心以去除不溶性聚集体（17,900×g）

星形胶质细胞培养物和分泌的ADEVs的特征

为了研究AβPF和sAPPα对ADEVs中miRNA成分的影响，我们使用了一种能够产生高度富集的星形胶质细胞群体的培养系统，以消除其他来源的污染EVs。星形胶质细胞培养物分别暴露于载体或含有0.1 μM AβPF、1 nM sAPPα或1 nM sAPPα与0.1 μM AβPF的培养基中24小时，然后彻底清洗以去除处理物质。每个组培养4个细胞，之后继续孵育

讨论

越来越多的证据表明，星形胶质细胞的生理和功能紊乱会促进AD病理（Beretta等人，2020年；Pekny等人，2016年；Singh等人，2020年；S?llvander等人，2016年）。此外，在AD患者、AD动物模型和暴露于Aβ后的培养神经元中也观察到了miRNA表达的改变（Dursun等人，2019年；Guévremont等人，2022年；Higaki等人，2018年；Hu等人，2015年；Kenny等人，2019年；Li等人，2014年；Miya Shaik等人，2018年，

数据可用性

本研究生成的数据集可应请求向相应作者索取。

未引用的参考文献

Pe?a-Bautista等人（2022年）。

CRediT作者贡献声明

艾米·J·朱（Aimee J. Chu）：撰写——初稿、可视化、方法学、研究设计、资金获取、正式分析、概念构思。安娜·埃尔兰德松（Anna Erlandsson）：撰写——审稿与编辑、监督、资源管理、项目管理、资金获取、概念构思。乔安娜·M·威廉姆斯（Joanna M. Williams）：撰写——审稿与编辑、监督、资源管理、项目管理、资金获取、概念构思。

资助

本研究得到了瑞典阿尔茨海默基金会、瑞典研究委员会和奥塔哥大学校长捐赠基金的支持。艾米·朱还获得了新西兰脑研究博士奖学金和奥塔哥大学出版津贴。

致谢

作者感谢Katie Bourne博士和Warren Tate教授提供的重组蛋白，以及Courteney Westlake在稿件校对和提供有益评论方面的帮助。