《The Journal of Gene Medicine》：Development of CpG-Depleted CFTR Plasmid-Based Nanoparticles for Nonviral Gene Therapy in Lung Cystic Fibrosis Disease
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针对非病毒基因治疗中CFTR蛋白表达短暂及CpG序列引发免疫应答的难题，本研究构建了含CpG缺失、密码子优化CFTR序列及hEF1α启动子的质粒，结合HPAE载体形成纳米颗粒。结果显示，该体系在CFBE41o-细胞中48小时CFTR蛋白表达较健康细胞提升约20倍，7天仍维持2.26倍于16HBE14o-的水平，显著优于CMV启动子。这为克服肺囊性纤维化（CF）基因治疗的关键瓶颈提供了新策略，具有重要临床转化潜力。
在肺部疾病领域，囊性纤维化（Cystic Fibrosis, CF）长期以来都是困扰医学界的难题。尽管随着医疗进步，患者的生存期有所延长，但现有的支气管扩张剂、黏液稀释剂和抗生素等治疗手段，大多只能缓解症状，无法从根本上治愈疾病。近年来，虽然针对特定突变（如F508del和G551D）的调节剂疗法取得了一定成效，但仍有约10%的患者因突变类型不匹配而无法受益。在这样的背景下，基因添加（gene addition）疗法——即通过引入健康的CFTR基因来替代功能缺失的蛋白——因其突变非依赖性和靶向疾病根源的特性，成为了极具潜力的研究方向。然而，从实验室走向临床的道路并非坦途，非病毒基因治疗面临着一个核心挑战：CFTR蛋白的表达往往是“昙花一现”，难以持久；同时，质粒中普遍存在的CpG序列会激活体内的 Toll 样受体 9（TLR9），引发免疫反应，限制了其治疗效果。如何打破这层“玻璃天花板”，实现高效且长效的 CFTR 表达，成为了摆在科研人员面前的一道必答题。
为了攻克这一难关，来自国内外研究团队（由B.Q.、I.L.-S.、W.W.等主导）展开了一项系统性工作，旨在通过多维度的质粒优化，开发出一种能够用于肺 CF 治疗的新型非病毒基因递送系统。他们的研究成果最终发表在《The Journal of Gene Medicine》上，展示了一种结合了CpG缺失、密码子优化、S/MAR序列以及hEF1α启动子的新型CFTR质粒，并利用高度支化的聚（β-氨基酯）（Highly Branched Poly(β-amino ester)s, HPAEs）作为载体，成功实现了在体外模型中长效且高效的CFTR蛋白表达。
为了实现这一目标，研究人员主要采用了以下几个关键技术方法：首先，通过序列改造，构建了包含野生型（WT-CFTR）和密码子优化型（OP-CFTR）的多种CFTR质粒，并引入了S/MAR（支架/基质附着区）序列及CpG缺失的骨架；其次，选用了CF患者来源的CFBE41o-细胞系（携带Phe508del纯合突变）和健康供体的16HBE14o-细胞系作为体外模型；接着，利用HPAEs聚合物将质粒压缩成纳米颗粒进行细胞转染；最后，通过Western blot（蛋白质印迹）、RT-qPCR（逆转录定量聚合酶链式反应）和免疫荧光等技术，从蛋白水平、mRNA水平及亚细胞定位多个维度，评估了不同构建体的表达效率与持续时间。
3.1 CFTR Plasmids Construction
研究人员首先在质粒构建阶段就遇到了挑战：原始的CFTR cDNA中存在隐蔽启动子（cryptic promoter），导致在大肠杆菌扩增时发生重排和突变。为此，他们通过同义突变去除了这一障碍，成功构建了第一代质粒pUC-hCEFIα-WT-CFTR（pWT-CFTR1）。随后，为了进一步提升性能，团队引入了S/MAR序列并更换为CpG缺失的骨架，得到了pWT-CFTR2；同时，基于已发表的OP-CFTR序列（经过密码子优化且无CpG），构建了pUC-hCEFIα-OP-CFTR（pOP-CFTR1）。最终，结合了所有优化策略的“集大成者”——R6K-hCEFIα-OP-CFTR（pOP-CFTR2）被成功制备。质量分析显示，pOP-CFTR2不仅具有更高的超螺旋比例，其质粒产量也显著提升，为后续实验奠定了坚实基础。
3.2 CFTR Protein Expression
在CFBE41o-细胞中进行的蛋白表达实验揭示了各构建体的优劣。与pWT-CFTR1相比，pWT-CFTR2（引入S/MAR和CpG缺失骨架）使CFTR蛋白表达增加了2.16倍；pOP-CFTR1（采用OP-CFTR序列）提升了1.70倍。而最终的优化版本pOP-CFTR2表现最为惊艳，其CFTR蛋白表达量达到了pWT-CFTR1的4.10倍。特别值得注意的是，代表成熟且可转运至细胞膜发挥功能的CFTR蛋白Band C，在pOP-CFTR2组中比健康对照细胞高出14.54倍。免疫荧光结果也直观证实了pOP-CFTR2具有最高的蛋白表达水平，确立了其作为后续研究首选候选者的地位。
3.3 hEFIα Promoter and hCMV Promoter Comparison
启动子的选择对基因治疗的持久性至关重要。研究对比了常用的强力病毒启动子hCMV与内源性哺乳动物启动子hEF1α。时间进程研究表明，虽然hCMV启动子在转染后24小时内表现出更高的CFTR mRNA水平（分别为健康细胞的66.42倍 vs 9.73倍），但其蛋白表达衰减迅速。相反，hEF1α启动子在48小时和7天后展现出更强的持久力：7天后，HPAEs/pOP-CFTR2组的CFTR蛋白表达量达到了健康细胞的2.26倍，而hCMV组仅为1.18倍。这表明，尽管hCMV初期爆发力强，但hEF1α在长效表达上具有不可替代的优势，使得pOP-CFTR2成为平衡效率与持久性的最佳选择。
综合来看，这项研究通过精妙的分子工程设计，成功解决了非病毒CF基因治疗中表达效率低和持续时间短的两大痛点。讨论部分指出，通过将CpG缺失、密码子优化、S/MAR序列整合到带有hEF1α启动子的质粒中，并结合高效的HPAE递送系统，研究人员在CFBE41o-细胞中实现了超过野生型10%的CFTR蛋白表达阈值，且在7天后仍能维持这一水平。这不仅验证了该平台在克服质粒表观遗传沉默方面的有效性，也为未来的临床应用铺平了道路。尽管由于质粒作为游离体（episome）在细胞分裂中存在丢失风险，导致7天后表达有所下降，但其在体外模型中的卓越表现，特别是相较于传统CMV启动子的显著优势，标志着我们在开发安全、有效且持久的肺囊性纤维化非病毒基因疗法上迈出了坚实的一步。
