《Phytomedicine》：Rhoifolin Inhibits Ferroptosis and Alleviates Pulmonary Arterial Hypertension via the TNF-α/TNF-R1/CASP8/CASP3 Pathway
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肺动脉高压（PAH）是一种由血管重塑驱动的致命性疾病，铁死亡与其病理机制密切相关。本研究首次通过整合网络药理学、分子对接和动态模拟，证实天然黄酮类化合物Rhoifolin（ROF）可抑制铁死亡，通过调控TNF-α/TNF-R1/CASP8/CASP3信号轴减轻PAH。体外实验显示ROF逆转Erastin诱导的PASMC铁死亡，体内实验证实其改善PAH血流动力学指标，降低Fe2?和MDA水平，提升GSH和GPX4表达。
邓少东|廖耀贤|谢金城|庞志忠|谢青贤|肖梦园|陈建英
广东医科大学，中国广东省东莞市523808
摘要
背景
肺动脉高压（PAH）是一种由进行性血管重塑驱动的致命疾病。新兴证据表明，铁死亡（一种依赖铁的调控性细胞死亡形式）与PAH的发病机制有关，这表明抑制铁死亡是一种有前景的治疗策略。Rhoifolin（ROF）是一种具有多种生物活性的天然黄酮类化合物，但其在PAH中的研究尚未开展。
目的
本研究旨在系统探讨ROF对抗PAH的治疗潜力，重点关注其抑制铁死亡的作用及其潜在的分子机制。
方法
采用综合方法进行研究。网络药理学预测了ROF、铁死亡和PAH的共同靶点。通过分子对接和动力学模拟评估了结合稳定性。在体外使用Erastin刺激的大鼠肺动脉平滑肌细胞（rPASMCs）以及在体内使用单硝酸甘油酯诱导的PAH大鼠模型对预测结果进行了严格验证。
结果
生物信息学分析确定了60个共同靶点，并指出脂质和动脉粥样硬化通路中的TNF-α/TNF-R1/CASP8/CASP3轴是关键机制。体外实验显示，ROF能够直接保护rPASMCs免受Erastin诱导的铁死亡；体内实验表明，ROF治疗可改善血流动力学指标和血管重塑情况，降低肺铁死亡标志物（Fe2?、MDA）水平，并恢复抗铁死亡防御机制（GSH、GPX4）。同时，ROF还下调了TNF-α/TNF-R1/CASP8/CASP3轴相关蛋白的表达水平。计算研究证实了ROF与这些靶点的稳定结合。
结论
本研究首次证明ROF通过抑制铁死亡来缓解PAH，这一机制与TNF-α/TNF-R1/CASP8/CASP3信号通路的调节有关。我们的发现表明ROF是一种具有多靶点作用的新颖PAH治疗候选物。
引言
肺动脉高压（PAH）的血液动力学定义是静息状态下平均肺动脉压（mPAP）大于20毫米汞柱（Humbert等人，2022年）。其主要组织病理学特征包括持续的血管收缩、血管重塑、血管周围炎症和坏死，导致血管腔狭窄甚至阻塞。这逐渐增加右心室的负担，最终导致右心室衰竭（Hassoun，2021年；Hemnes等人，2022年）。流行病学数据显示，PAH的患病率为每百万成年人中有48-55例（Leber等人，2021年）。如果不及时治疗，PAH可能导致右心衰竭甚至死亡。目前的PAH治疗方法主要包括拮抗内皮素通路、刺激一氧化氮-cGMP通路或通过前列腺素通路进行治疗。这些方法旨在改善PAH患者的症状、运动能力和血流动力学参数。然而，靶向治疗通常成本较高，预后较差，并伴有许多不良反应（Humbert等人，2022年；Ruopp和Cockrill，2022年）。多项研究表明，中药活性成分具有治疗PAH的显著潜力（Wang等人，2024年；Xue等人，2021年）。例如，木犀草素是一种广泛存在于中药和天然食品中的膳食黄酮类化合物。研究显示，木犀草素可以抑制PASMCs的异常增殖，逆转PAH大鼠的肺血管重塑，并使PAH相关代谢物（如LTB4和PGE2）的表达水平恢复正常（Song等人，2022年）。天然小分子活性成分在治疗PAH方面具有巨大潜力，但仍需进一步深入研究以确认其安全性和临床应用价值。
铁死亡是一种非凋亡形式的细胞死亡，其特征是脂质过氧化和铁过载（Guo等人，2022年）。诱导铁死亡的因素可以通过多种途径直接或间接调节谷胱甘肽过氧化物酶4（GPX4），导致细胞抗氧化能力下降和活性氧（ROS）积累，最终引发细胞氧化死亡（Li等人，2020年）。铁死亡与多种心血管疾病密切相关，包括PAH、心肌病、心肌梗死和心力衰竭（Wu等人，2021年）。例如，在单硝酸甘油酯诱导的PAH大鼠模型中，观察到肺动脉内皮细胞发生铁死亡，表现为铁死亡相关标志物（如GPX4和铁蛋白重链1（FTH1）的表达异常降低。研究发现，细胞铁死亡可能通过HMGB1/TLR4/NLRP3信号通路的调节介导，从而加剧血管炎症并促进PAH进展（Xie等人，2022年）。此外，研究表明，在单硝酸甘油酯诱导的PAH大鼠模型中，PRDX6可通过释放HMGB1并激活TLR4/NLRP3炎症小体信号通路来介导肺动脉内皮细胞的铁死亡，从而影响PAH的进展（J等人，2023年）。这些发现表明PAH与铁死亡之间存在密切关系。
Rhoifolin（ROF，木犀草素7-O-β-新橙皮苷）是一种属于木犀草素家族的黄酮类化合物，存在于多种中药和天然植物中，如柑橘类果皮、莲子心、柑橘类水果、漆树属植物和柠檬（Brinza等人，2020年；Fang等人，2020年；Huang等人，2023年；Zheng等人，2022年）。ROF具有多种生物活性，包括抗炎、抗氧化、抗凋亡和抗脂质过氧化作用（Brinza等人，2020年；Mai等人，2022年；Wen等人，2023年）。最新研究表明，ROF通过调节CEMIP/SLC7A11信号通路促进谷胱甘肽（GSH）生物合成，有效抑制葡聚糖硫酸钠（DSS）诱导的小鼠急性结肠炎模型中的上皮细胞铁死亡（Liu等人，2024年）。此外，在博来霉素诱导的肺纤维化模型中，ROF通过激活铁死亡相关的Nrf2/HO-1信号通路，有效抑制氧化应激、减少炎症细胞浸润和上皮-间充质转化（EMT），从而显著改善肺纤维化程度（Wang等人，2025年）。鉴于肺纤维化和PAH在病理机制上的相似性（如炎症驱动的血管重塑和基质沉积），以及ROF的显著抗氧化和抗炎作用，我们推测ROF也可能对PAH具有保护作用。然而，目前尚无研究报道ROF是否能改善PAH或其作用机制是否涉及调节铁死亡。因此，为了探讨其在PAH中的潜在机制，我们结合了网络药理学、计算模拟（对接和分子动力学）和实验验证，以确定ROF是通过抑制铁死亡发挥作用的。这项研究为开发新的PAH治疗方法提供了关键证据和有希望的候选物。
PAH和铁死亡相关基因集合
使用“pulmonary arterial hypertension”作为搜索词，我们从多个数据库中收集了与PAH相关的靶基因，包括GeneCards（Stelzer等人，2016年）、DISGENET（Pi?ero等人，2020年）和OMIM（Amberger等人，2015年）。合并选定的靶基因并去除重复条目，得到了最终的PAH靶基因数据集。同样，我们使用“ferroptosis”作为搜索词从GeneCards数据库中检索了与铁死亡相关的靶基因。
PAH和铁死亡相关基因集合
从GeneCards、DISGENET和OMIM中分别检索到1,772个、413个和294个与PAH相关的基因。合并并去除重复条目后，共鉴定出2,142个独特基因。从GeneCards、NCBI和Ferrdb中收集了与铁死亡相关的基因数据，分别得到1,407个、636个和564个基因。去重后，获得了1,737个独特基因（补充表1和2）。ROF的潜在靶点
使用PharmMapper和Swiss Target软件确定了ROF的潜在靶点讨论
PAH是一种影响心脏和肺部的心血管疾病，由多种因素导致肺血管收缩和肺动脉重塑，最终引起右心衰竭。PAH的发病机制尚未完全明了。最新研究表明，铁死亡可通过肺血管中的代谢和炎症机制促进PAH的发展，而使用铁死亡抑制剂已被证明可以缓解PAH并改善右心室功能
结论
本研究表明，ROF通过抑制TNF-α/TNF-R1/CASP8/CASP3轴发挥作用，从而降低大鼠肺组织中的Fe2?和MDA水平，增加GSH和GPX4的表达水平，最终抑制铁死亡，从而改善PAH。这些发现全面探讨了ROF在抑制铁死亡和改善PAH方面的潜在靶点和相关机制，为ROF的药物开发和其在PAH中的应用提供了科学依据。
作者贡献声明
邓少东：概念提出、方法学设计、验证、数据分析、原始稿撰写、审稿与编辑、监督、资源协调、项目管理和资金获取。廖耀贤：方法学设计、软件使用、验证、数据分析、调查、原始稿撰写。谢金城：方法学设计、验证。庞志忠：验证、数据分析。谢青贤：验证。肖梦园：概念提出、资金获取。
作者贡献声明
邓少东：撰写 – 审稿与编辑、原始稿撰写、验证、监督、资源协调、项目管理和资金获取、方法学设计、数据分析、概念提出。廖耀贤：原始稿撰写、验证、软件使用、方法学设计、调查、数据分析。谢金城：验证、方法学设计。庞志忠：验证、数据分析。谢青贤：验证。肖梦园：资金获取、概念提出。利益冲突声明
作者声明他们没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文的研究结果。
致谢
本研究得到了国家自然科学基金（81370242）、湛江市科技计划（2022A01183、2022A01166和2024B01336）、全国大学生创新创业培训计划（202410571036X）、广东省大学生创新创业培训计划（S202410571081）以及广东医科大学本科生创新创业教育基地项目（JDXM2024066F）的支持。
