《Journal of Integrative Plant Biology》：Pentatricopeptide repeat proteins in crops: Advances in functional mechanisms and breeding applications
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这篇综述系统总结了五肽重复序列（PPR）蛋白在主要禾谷类和油料作物中的功能机制研究进展。文章聚焦于PPR蛋白在调控幼苗生长、胁迫响应、种子发育及细胞质雄性不育（CMS）育性恢复中的核心作用，揭示了其通过调控叶绿体和线粒体RNA代谢来协调核-细胞器通讯的关键功能。文中还展望了工程化设计PPR（dPPR）蛋白作为可编程RNA靶向工具在作物精准育种中的应用潜力，为相关领域研究者提供了全面而深入的参考。
在作物的生命活动中，叶绿体和线粒体这两个能量工厂扮演着至关重要的角色。它们并非完全独立，其功能的正常运行高度依赖于细胞核的精密调控。其中，由核基因编码、靶向细胞器的五肽重复序列（Pentatricopeptide repeat, PPR）蛋白家族，正是协调这种“核-细胞器对话”的核心分子桥梁。这篇综述将带我们深入了解PPR蛋白如何在主要粮食和油料作物中，通过一系列精巧的RNA“加工”操作，深刻影响着作物的生长发育、逆境适应乃至繁殖能力。
PPR蛋白的结构与功能多样性
PPR蛋白家族是开花植物中最大的核编码基因家族之一，在拟南芥中超过450个成员，在水稻和玉米中也各有约400个成员。它们通常由单个外显子编码，大多数定位于线粒体或叶绿体。其结构特征鲜明：包含N端的亚细胞定位信号肽，以及紧随其后的2至30个串联重复的PPR基序（每个基序约35个氨基酸）。根据基序组成，PPR蛋白主要分为P型和PLS型两大类。P型亚家族仅包含经典的P基序，而PLS型成员则呈现出P、长L和短S三种不同长度基序的有序排列。
功能上的分化也体现在它们的C端结构域上。一些P型蛋白可能携带一个小的MutS相关（SMR）结构域，赋予其RNA内切酶活性；而PLS型成员通常包含保守的E、E+和DYW结构域，并因此被称为PPR-E、PPR-E+和PPR-DYW蛋白。值得注意的是，PPR-DYW蛋白的DYW结构域本身具有胞苷脱氨酶活性，能够直接催化RNA编辑中的C-to-U（胞苷到尿苷）转换。
尽管PPR蛋白家族庞大且分布广泛，但它们执行着高度特异化的功能。P型PPR主要通过多样化过程调控细胞器中的RNA代谢：促进转录本剪接、介导RNA稳定、进行RNA切割、调控翻译（包括起始和阻断），以及干扰蛋白质相互作用。相反，PLS型成员则通过与多种辅助因子（如多细胞器RNA编辑因子、细胞器RNA识别基序蛋白等）形成编辑体复合物，来协调RNA编辑。
PPR蛋白与靶标RNA的识别遵循一套模块化的“PPR密码”，其中每个PPR基序通过其第五位和最后一位的关键氨基酸残基与特定核苷酸结合。这种特异且持久的结合有时足以保护RNA免受核酸酶降解，从而形成“RNA足迹”，这为推断单个PPR蛋白的活性提供了线索。
PPR蛋白在作物生物学中的多功能角色
在作物中，PPR蛋白作为关键的多功能调节因子，其核心功能主要体现在四个维度：
- 1.
幼苗生长调控：对维持正常幼苗发育不可或缺，许多ppr突变体表现出褪绿表型。
- 2.
种子发育：对种子发育至关重要，许多ppr突变体产生胚和胚乳发育停滞的缺陷种子。
- 3.
细胞质雄性不育（CMS）育性恢复：PPR蛋白可作为育性恢复（Rf）基因。在CMS作物品系中，引入编码PPR的Rf基因可将花粉不育逆转为可育，恢复繁殖能力。
- 4.
胁迫响应调节：PPR蛋白介导作物对生物和非生物胁迫的适应。例如，一些ppr突变体表现出温敏褪绿表型，而另一些则显示出对病原体增强的抗性或对盐胁迫的耐受性。
PPR蛋白通过叶绿体RNA处理调控幼苗光合作用
人类消费的食物最终源自光合作用。叶绿体作为光合作用场所，其功能的正常建立与维持，依赖于叶绿体基因组编码的光合作用相关基因的转录后加工和翻译。大量研究表明，定位于叶绿体的PPR蛋白直接或间接参与了这些过程，其功能缺陷可能导致作物幼苗光合作用受阻。
在水稻和玉米这两种全球最重要的谷物作物中，已有超过33个定位于叶绿体的PPR蛋白被报道。这些蛋白的功能缺失通常导致叶绿素缺陷表型、叶绿体结构改变以及幼苗致死，这些都是光合作用缺陷突变体的典型特征。PPR蛋白通过协调编码叶绿体ATP合酶、叶绿体核糖体和光合复合体核心亚基的细胞器RNA的转录后加工，来影响叶绿体活性。
目前报道显示，定位于叶绿体的P型PPR蛋白主要通过RNA稳定和内含子剪接来处理RNA，而PLS型蛋白通常在叶绿体RNA编辑中发挥作用。例如，玉米PPR10蛋白通过结合atpI-atpH和psaJ-rpl33基因间区来稳定RNA，其突变导致黄化幼苗；玉米THA8蛋白参与ycf3-2和trnA内含子的剪接，突变引起叶片浅绿和幼苗致死；而玉米ZmPPR26作为一个PPR-DYW蛋白，负责atpA、ndhF等多个转录本的编辑，其功能丧失导致白化苗致死。
有趣的是，许多定位于叶绿体的PPR蛋白功能表现出温度敏感性。例如，水稻TCD10、OsV4、CDE4、OsATP4、YLWS、DUA1和WSL5等基因的突变体，在低温（如20°C）下呈现白化或褪绿表型，但在较高温度（如30°C或自然田间条件下）又能恢复正常绿色。这表明PPR蛋白介导的叶绿体RNA代谢过程受到温度的精细调控，这可能是作物适应环境温度波动的一种机制。
PPR蛋白通过线粒体RNA处理调控种子发育与胁迫响应
与动物不同，植物的种子是胚胎、胚乳和母本组织的复杂组合。线粒体为种子发育，特别是合子激活后的胚胎发生和胚乳发育，提供所需的能量和中间代谢物。线粒体RNA的精确加工，包括剪接和编辑，对于种子正常发育至关重要，而PPR蛋白在其中扮演了核心角色。
大量研究表明，编码线粒体定位PPR蛋白的基因发生功能丧失突变，会导致严重的种子缺陷。在玉米中，此类突变体常表现为“空稃”（empty pericarp）或“缺陷籽粒”（defective kernel）表型，胚和胚乳发育严重受阻甚至停滞。例如，DEK2、EMP603、EMP11、DEK37、EMP10、PPR20、EMP16、EMP12、PPR21、DEK35、PPR18、DEK41、DEK43、EMP24/EMP602、EMP25、PPR101、ZmSMK9、PPR231、PPR14、PPR-SMR1、SPR2等基因的突变，均影响到nad1、nad2、nad4、nad5、nad7等线粒体复合物I（NADH脱氢酶）亚基编码基因内含子的剪接，从而导致种子发育异常。同样，在水稻中，FLO10、RL1、PPR5等基因突变也因影响线粒体RNA剪接，导致胚乳粉质、胚根发生缺陷或幼苗生长迟缓。
除了剪接，PPR蛋白介导的线粒体RNA编辑也对种子发育至关重要。玉米DEK46、DEK605、EMP17、DEK39、DEK10、PPR2263、ZmSMK1、DEK36、EMP7、PCW1、bCCP1、SMK4、EMP18、DEK40等基因参与特定转录位点的编辑，其突变导致籽粒变小、皱缩、胚和胚乳发育延迟或致死。水稻OsSMK1的突变也引起胚胎和胚乳发育异常，导致胚胎或幼苗致死。
不仅如此，定位于线粒体的PPR蛋白还积极参与作物的胁迫响应。例如，水稻SOP10（PPR-E型）通过影响nad4内含子1、nad5内含子1等位点的剪接和编辑，在幼苗期增强植物的耐冷性。水稻PPR035和PPR406（均为PPR-DYW型）分别通过编辑rps4-926/orfX-406和orfX-355位点，增强幼苗对干旱和盐的耐受性。而水稻OsNBL3（P型）通过剪接nad5内含子4，同时增强了对病害的抵抗力和对盐的耐受性。这些发现揭示了PPR蛋白在作物抗逆育种中的潜在价值。
PPR蛋白作为育性恢复基因的应用
细胞质雄性不育（CMS）是一种母系遗传的性状，表现为植物不能产生有功能的花粉，其在杂交种制种中具有重要应用价值。通过引入核编码的育性恢复（Rf）基因可以恢复CMS系的花粉育性。在许多作物中，Rf基因被鉴定为编码PPR蛋白。
CMS/Rf系统的工作原理通常涉及“毒药-解药”模型。CMS表型通常由线粒体基因组重组产生的嵌合开放阅读框（ORF）表达的有毒蛋白引起，这些蛋白干扰线粒体功能导致不育。而Rf基因编码的PPR蛋白，可以通过结合并切割这些有毒蛋白的转录本，或促进其转录本发生不正常的编辑，从而阻止有毒蛋白的产生，最终恢复育性。例如，在玉米、水稻、油菜等多种作物中，都鉴定到了作为Rf基因的PPR蛋白。对PPR型Rf基因的克隆和功能解析，不仅深化了对作物生殖发育的理解，也为高效利用CMS系统进行杂交育种提供了关键基因资源。
工程化PPR蛋白：迈向精准育种的新工具
对PPR蛋白结构与功能，特别是“PPR密码”的深入理解，催生了一个新兴领域：工程化设计PPR（designer PPR, dPPR）蛋白。研究人员可以根据目标RNA序列，理性设计PPR蛋白的基序排列，从而创造出能够特异性结合并操纵任何目标RNA序列的人工蛋白。
这些dPPR蛋白可以与不同的功能域融合，成为强大的可编程RNA靶向工具。例如，融合脱氨酶域（如DYW域）可以用于精确的RNA编辑；融合核酸酶域（如SMR域）可以实现特定位点的RNA切割；而融合翻译激活或抑制域则可以调控特定蛋白的翻译。这为在作物细胞器中进行精准的基因操纵提供了前所未有的可能。与核基因组编辑相比，细胞器基因组编辑一直是个挑战，dPPR技术有望突破这一瓶颈，实现对叶绿体和线粒体基因组的定向改良，从而培育出更高产、抗逆、优质的作物新品种。
总结与展望
PPR蛋白作为一个庞大的核编码蛋白家族，在协调作物核-细胞器通讯中处于核心地位。它们通过对叶绿体和线粒体RNA代谢的多层次精细调控，广泛影响着幼苗光合作用、种子发育、育性恢复和非生物/生物胁迫响应等关键农艺性状。过去十年的研究不仅在多种作物中鉴定和解析了大量PPR蛋白的功能，揭示了其作用机制，更重要的是，为将PPR蛋白，特别是工程化的dPPR蛋白，开发成革命性的作物精准育种工具奠定了基础。未来，进一步解析PPR蛋白复合体的组装、环境因素对其功能的调控等未解问题，并推动dPPR技术在育种中的实际应用，将是该领域充满希望的发展方向。
