《Phytomedicine》：Alisol B as a novel inhibitor of T
βRs suppresses the growth and metastasis of non-small cell lung cancer by inhibiting TGF-
β-induced epithelial-mesenchymal transition
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非小细胞肺癌（NSCLC）中TGF-β1诱导的上皮-间质转化（EMT）促进肿瘤转移。本研究发现，来自水生植物的三萜类化合物Alisol B通过直接结合并抑制TGF-β受体1（TGFβR1）和2（TGFβR2）的ATP结合位点，促进TGFβR2的蛋白酶体降解，减少TGFβR1磷酸化，从而抑制Smad和MAPK/PI3K/Akt信号通路，显著降低体外细胞增殖、迁移和侵袭能力，以及体内肺癌生长和小鼠肺转移。分子动力学、表面等离子共振等验证了Alisol B与TGFβR的相互作用机制。
李柳瑶|王圆如|张晓倩|杨雪|李玉倩|雷琪琪|顾思萌|刘帅帅|向柳燕|曹亚军|刘志勇|李学军
化学与化学工程学院/教育部新疆植物药资源与利用重点实验室，石河子大学，新疆石河子，832003，中国
摘要
背景
非小细胞肺癌（NSCLC）是全球癌症相关死亡的主要原因之一，部分原因在于其侵袭性的转移行为。TGF-β1诱导的上皮-间充质转化（EMT）在NSCLC的进展和转移中起着关键作用。从泽泻属植物中提取的三萜类化合物ALB具有已证实的抗癌特性。然而，其对NSCLC的治疗效果及其作用机制仍不甚明确。
目的
我们研究了TGF-β受体（TβRs）是否参与了ALB对NSCLC生长和转移的抑制作用。
方法
体外实验中，我们使用CCK-8细胞增殖实验、克隆形成实验、伤口愈合实验和Transwell迁移实验来评估ALB对TGF-β1诱导的肺腺癌细胞（LUAD）的增殖、迁移和侵袭能力的影响。此外，我们还利用网络药理学方法预测潜在的信号通路。通过Western blotting和免疫荧光技术检测了TGF-β1诱导的LUAD细胞中的EMT相关标志物和机制。体内实验中，我们使用了LLC肿瘤小鼠模型和B16-F10肺转移小鼠模型来研究ALB对肿瘤生长和肺转移的影响。采用H&E染色技术进行组织病理学分析。我们还通过分子对接、分子动力学模拟（MD模拟）、表面等离子体共振（SPR）、药物亲和力响应靶点稳定性（DARTS）和细胞热位移实验（CETSA）研究了ALB与TGF-β受体之间的相互作用。细胞转染实验用于验证ALB的效果。
结果
本研究表明，ALB抑制了TGF-β1诱导的LUAD细胞的增殖、迁移、侵袭以及EMT过程，并在体内抑制了肿瘤生长和肺转移。一系列技术，包括分子对接、MD模拟、SPR、DARTS和CETSA，共同证明了ALB在药理浓度下可以直接与TGF-β受体1型（TGFβR1）和TGF-β受体2型（TGFβR2）的ATP结合位点结合，进而促进TGFβR2的蛋白酶体降解，导致TGFβR1的磷酸化减少，从而抑制了经典的（TGF-β/Smad）和非经典的（MAPK和PI3K/Akt）信号通路。此外，在敲低TGFβR1和TGFβR2的A549细胞中，ALB对迁移、侵袭和EMT过程的抑制作用显著减弱，表明ALB有效抑制了TGFβR1和TGFβR2的激酶活性。
结论
我们的发现表明，ALB作为一种新型的TβRs抑制剂，在体外和体内均能有效抑制肿瘤生长和肺转移，通过抑制EMT过程发挥作用。
引言
肺癌仍然是全球最常见的恶性肿瘤，也是癌症相关死亡的主要原因。2022年全球肿瘤流行病学统计（GLOBOCAN）显示，新发肺癌病例约为250万例（Qin等人，2024年）。NSCLC占所有肺癌病例的约85%（Sung等人，2021年）。遗憾的是，近90%的肺癌死亡归因于肿瘤转移。在疾病进展过程中，EMT介导的机制是主要驱动因素（Fan等人，2023年）。除了手术、放疗和化疗等传统治疗方法外，肺癌治疗越来越多地结合免疫疗法和靶向治疗（Alduais等人，2023年）。然而，由于治疗耐药性、转移以及疾病的生物学复杂性等因素的相互作用，肺癌死亡率的显著降低仍然难以实现，这突显了进一步研究和创新治疗方法的迫切需求。
历史上，天然产物因其易获取性、成本效益低和低毒性而长期被用作多种疾病的治疗剂（Qin等人，2024年）。ALB是从泽泻属植物根茎中提取的一种生物活性三萜类化合物，具有多种药理作用，包括抗癌活性、调节脂质代谢和抗炎作用（Yoshida等人，2017年；Zhang等人，2023a；Zhao等人，2022年）。在肿瘤学领域，ALB通过激活半胱天冬酶、诱导细胞凋亡、破坏线粒体膜电位、阻断细胞周期和积累活性氧（ROS）在MDA-MB-231细胞中表现出抗增殖作用（Zhang等人，2017年）。此外，ALB通过靶向肌质/内质网Ca2+ ATP酶在肿瘤细胞中诱导自噬、细胞凋亡和内质网应激（Law等人，2010年）。我们之前的研究首次发现ALB可能通过下调CDK1和Cyclin E1来抑制NSCLC细胞的增殖（Xiang等人，2024年）。然而，其抑制NSCLC生长和转移的分子机制仍需进一步阐明。
肿瘤微环境的特征是TGF-β1表达水平升高（Ikushima和Miyazono，2010年）。TGF-β1通过驱动恶性组织中的EMT，使上皮细胞从多边形形态转变为类似间充质细胞的纺锤形（Xu等人，2009年）。上皮细胞标志物（如E-钙粘蛋白）下调，而间充质细胞标志物（如N-钙粘蛋白和波形蛋白）上调。这种转变是EMT的特征，促进了癌症的侵袭和转移。相关的转录因子（如Snail和Zeb1/2（Taki等人，2021年）通过ROS、Smad、MAPK、PI3K和Notch等通路参与EMT，从而促进肿瘤转移。TGF-β1刺激后，TGFβR2与TGFβR1二聚化并使其磷酸化。这一激活级联反应随后诱导Smad2/3转录因子的磷酸化，最终驱动EMT相关基因的转录重编程（Dijke等人，1996年；Shi和Massagué，2003年）。
目前，植物来源的天然化合物Ugonin L通过双重抑制TGFβR1/TGFβR2激酶活性，阻断TGF-β/Smad和非经典（PI3K/Akt/mTOR）信号通路，在临床前模型中表现出强大的抗纤维化效果（Hsia等人，2025年）。此外，GW788388是一种强效的双重TGFβR1/TGFβR2激酶抑制剂，在肾癌临床前模型中通过抑制TGF-β诱导的Smad激活和靶基因表达表现出抗纤维化效果（Petersen等人，2008年）。一些针对TβRs的药物已被证明能有效抑制肿瘤转移（Verdura等人，2022年；Zhang等人，2023b；Zhao等人，2024年），例如LY2109761，这是一种口服可用的双重TGFβR1/TGFβR2激酶抑制剂（Ki值分别为38 nM和300 nM），在临床前胰腺癌模型中抑制信号通路并抑制肿瘤生长和转移（Melisi等人，2008年）。然而，由于这些药物对心脏和肠道的毒性较大，其在临床癌症治疗中的应用受到限制（Lahn等人，2015年；Mohammad等人，2011年）。因此，通过研发将TGF-β抑制剂推进到临床实践是一个紧迫的治疗优先事项。因此，使用抑制剂靶向TGF-β信号通路可能是治疗NSCLC转移的有希望策略。然而，尚需确定ALB是否通过抑制TβRs来防止NSCLC转移。
在本研究中，我们展示了ALB在体内和体外对NSCLC的抗肿瘤作用。我们探讨了TβRs是否是ALB抑制NSCLC转移的机制基础。为了阐明ALB在NSCLC中的抗转移机制，我们在体外建立了TGF-β1诱导的EMT模型，在体内建立了Lewis肺癌（LLC）肿瘤小鼠模型和B16-F10肺转移小鼠模型。基于分子对接、分子动力学（MD）模拟、表面等离子体共振分析（SPR）、细胞热位移实验（CETSA）和药物亲和力响应靶点稳定性（DARTS），我们确定ALB靶向TβRs并作为这些受体的强效抑制剂。我们预期这些发现共同提供了有力证据，支持ALB能够有效破坏对NSCLC肿瘤进展和转移至关重要的TβRs介导的信号通路的假设。
部分内容
动物和细胞
我们从新疆医科大学购买了6-8周大的C57BL/6J雄性小鼠。小鼠被饲养在温度控制在21 ± 1°C、光照12小时/黑暗12小时、相对湿度50-60%的受控环境中。它们可以自由获取标准啮齿动物饲料和水。本研究得到了石河子大学第一附属医院伦理委员会的批准（批准编号：A2020-139-01）。所有涉及小鼠的实验程序均按照规定进行。
ALB有效抑制LUAD细胞的生长以及TGF-β1诱导的恶性行为和侵袭性表型
为了探讨ALB对LUAD细胞增殖的影响，我们首先使用CCK-8实验观察了不同剂量（0.3至30）的ALB对LUAD细胞（A549、NCI-H1299、HCC827和NCI-H1975细胞）存活率的影响。如图1A-D所示，ALB以剂量依赖的方式显著降低了LUAD细胞的存活率，IC50值（24小时）分别为A549细胞13.5647 μM、NCI-H1299细胞16.3769 μM、HCC827细胞20.3304 μM和NCI-H1975细胞23.9703 μM。
讨论
肺癌是全球恶性肿瘤导致死亡的主要原因。尽管有免疫疗法和分子靶向疗法等现代治疗方法，肺癌的5年生存率仍然很低。因此，探索替代方法至关重要。植物来源的天然产物一直是抗癌药物的重要来源（Thomford等人，2018年）。研究表明，天然三萜类化合物ALB可以抑制MCF-7和MDA-MB-231乳腺细胞的增殖
结论
本研究表明，ALB在功能上抑制TβRs，有效抑制NSCLC的肿瘤生长和肺转移，尤其是在LUAD亚型中。机制上，ALB直接结合并抑制TGFβR1和TGFβR2，然后促进TGFβR2的蛋白酶体降解。相应地，ALB降低了TGFβR1的磷酸化，从而抑制了经典的（TGF-β/Smad）和非经典的（MAPK和PI3K/Akt）信号通路。
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李柳瑶：撰写 - 原始草案、软件使用、资源准备、方法学设计、数据整理、数据分析。王圆如：撰写 - 审稿与编辑、概念构思、验证、方法学设计、监督。张晓倩：撰写 - 审稿与编辑、方法学设计、数据分析、验证、软件使用。杨雪：数据分析、软件使用、验证、概念构思。李玉倩：数据分析、概念构思。雷琪琪：实验研究、概念构思。顾思萌：数据验证、实验研究
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致谢
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