基于肽基螯合剂序列优化的新型HER2靶向放射性肽探针[99mTc]Tc-CGGG-rL-A9的构建与评价

《Journal of Peptide Science》：Influence of Peptide-Based Chelator Sequences on HER2-Targeting Radiopeptide

为解决HER2阳性乳腺癌靶向分子影像探针开发中的难题，本研究将含Cys-Gly-Gly-Gly (CGGG)的肽基螯合剂引入靶向肽rL-A9，成功构建了[99mTc]Tc-CGGG-rL-A9。该探针展现出高标记率、稳定性、对SKBR3细胞的强结合亲和力(Kd: 5.82 ± 0.92 nM)与特异性，并在荷瘤鼠体内表现出较好的肿瘤摄取与清除特性，为开发更优的HER2靶向SPECT显像剂提供了新策略。

　　

乳腺癌是全球女性中发病率最高的恶性肿瘤之一，其中约有20-30%的病例存在人类表皮生长因子受体2 (Human Epidermal Growth Factor Receptor 2, HER2)的过表达。这种类型的乳腺癌通常更具侵袭性，转移风险也更高。因此，及早、准确地检测出HER2阳性肿瘤，对于制定精准的治疗方案至关重要。在现有的医学影像手段中，基于放射性核素的单光子发射计算机断层成像 (Single-Photon Emission Computed Tomography, SPECT) 因其成本相对较低、普及率高，成为一种极具潜力的选择。而开发针对HER2的分子探针，就如同为医生配备一副“特异”的眼镜，能让他们“看清”肿瘤的位置和状态。

以往的研究中，一种名为rL-A9的短肽因其能特异性结合HER2而备受关注。然而，当研究人员给它“挂上”一种常用的HYNIC螯合剂，并用临床常用的放射性核素锝-99m (^99mTc)标记后，得到的[^99mTc]Tc-HYNIC-rL-A9探针在细胞和动物体内的表现却不尽如人意，肿瘤摄取量很低。这促使科学家们思考：问题的关键是否出在“连接器”——螯合剂上？传统的HYNIC螯合剂在合成上可能需要额外步骤，其理化性质也可能影响整个探针分子的性能。于是，一项新的研究思路应运而生：能否将螯合功能直接“编程”到肽序列本身，设计出一种“肽基螯合剂”，在合成靶向肽的同时一步到位地构建出完美的“对接”位点？

本项发表于《Journal of Peptide Science》的研究正是为了解决上述问题。研究人员巧妙地利用^99mTc易于与含有氮(N)和硫(S)原子的配体形成稳定络合物的特性，设计了三种由半胱氨酸(Cys)与其他氨基酸组成的短肽序列：Cys-Gly-Gly-Gly (CGGG)、Cys-Ser-Ser-Gly (CSSG)和Cys-Glu-Glu-Gly (CEEG)。这些短肽序列在结构上恰好能提供一个N₃S型配位环境。研究团队将它们分别连接到HER2靶向肽rL-A9的N端，合成了三种新的肽衍生物：CGGG-rL-A9 (P1)、CEEG-rL-A9 (P2)和CSSG-rL-A9 (P3)。核心目标是评估哪一种肽基螯合剂能与^99mTc形成最稳定、最有效的靶向探针，从而为HER2阳性乳腺癌的精准影像诊断提供一个更优的候选工具。

关键研究方法概述

本研究主要运用了以下关键技术：1) 采用固相肽合成法(SPPS)合成了三种肽基螯合剂修饰的rL-A9肽(P1, P2, P3)；2) 利用分子对接技术模拟了最优肽P1与HER2受体的结合模式；3) 通过^99mTc放射性标记（标记前体为[^99mTc]NaTcO₄）和高效液相色谱(HPLC)分析评价了标记效率与体外稳定性；4) 在过表达HER2的人乳腺癌SKBR3细胞系上进行体外结合、抑制和内化实验，测定亲和力常数(K_d)；5) 在携带SKBR3肿瘤的SCID小鼠模型中进行体内生物分布研究，评估探针的肿瘤摄取、非靶器官清除及靶向特异性（通过预注射过量未标记肽进行阻断实验）；6) 在健康小鼠中进行体内代谢稳定性研究，分析尿液代谢物。

研究结果

3.1 合成

三种目标肽P1, P2, P3经合成、纯化后，纯度均大于99%，并通过电喷雾质谱(ESI-MS)确认了结构。

3.2 分子对接

分子对接模拟显示，CGGG-rL-A9 (P1)与HER2受体具有较低的结合自由能(-25.5 kJ/mol)，略优于未修饰的rL-A9 (-22.2 kJ/mol)。模型分析表明，CGGG序列中的基团可能与HER2受体上的氨基酸形成额外的氢键，这可能是其亲和力提升的结构基础。

3.3 放射性标记与体外稳定性

放射性标记结果显示，只有[^99mTc]Tc-P1 (CGGG-rL-A9)能够实现高效（>97%）且稳定的标记。而[^99mTc]Tc-P2 (CEEG-rL-A9)和[^99mTc]Tc-P3 (CSSG-rL-A9)不仅标记产率较低(<90%)，且在室温下快速分解（30-60分钟内降解超过85%）。[^99mTc]Tc-P1在磷酸盐缓冲液(PBS)中孵育6小时后仍保持>95%的完整性，在人血清中孵育4小时后也保持>90%的稳定性，证明了其优越的体外稳定性。由于其不稳定性，后续研究仅针对[^99mTc]Tc-P1展开。

3.4 细胞摄取研究

细胞实验证实，[^99mTc]Tc-P1能特异性结合HER2高表达的SKBR3细胞，摄取率为总放射性的1.16% ± 0.05%。当用过量未标记的rL-A9肽进行竞争抑制时，细胞摄取降低了63%，表明其结合具有高特异性。通过饱和结合实验测得其对HER2的平衡解离常数(K_d)为5.82 ± 0.92 nM，显示出纳摩尔级别的高亲和力。此外，约有20%与细胞结合的放射性在2小时内被内化到细胞内。

3.5 生物分布研究

在SKBR3肿瘤小鼠模型中的生物分布实验是评估探针体内性能的关键。[^99mTc]Tc-P1在注射后1小时显示出中等的肿瘤摄取(3.56 ± 0.81% ID/g)，并且在3小时后仍能保留约82.8%的放射性(2.95 ± 0.22% ID/g)，说明其在肿瘤部位有一定的滞留能力。更令人鼓舞的是，探针能从非靶器官（如肝脏、肠道）中快速清除，导致肿瘤与背景组织的比值随时间推移而显著提高。例如，肿瘤与血液、肿瘤与肌肉的比值在1小时到3小时间分别增长了3.1倍和4.6倍。阻断实验进一步证实了其靶向性：预先注射过量未标记肽可使肿瘤部位的放射性摄取降低52.6%。体内代谢稳定性研究显示，注射后2小时的小鼠尿液中约90%的放射性仍以原形探针存在，说明其在体内代谢稳定。

结论与讨论

本研究成功设计并评价了一种新型的基于肽基螯合剂的HER2靶向放射性探针[^99mTc]Tc-CGGG-rL-A9 ([^99mTc]Tc-P1)。研究结论明确：在三种测试的肽基螯合剂序列(CGGG, CEEG, CSSG)中，CGGG是与^99mTc形成稳定络合物的最优选择，而含有丝氨酸(Ser)或谷氨酸(Glu)的序列则导致标记物极不稳定。

与团队前期报道的使用传统HYNIC螯合剂的[^99mTc]Tc-HYNIC-rL-A9相比，本研究开发的[^99mTc]Tc-P1在多个方面实现了显著提升：其与HER2的亲和力从难以测定的低水平提高到5.82 nM；肿瘤摄取量提高了约6倍；并且具有更优的药代动力学特征，表现为从非靶器官（特别是肝脏和肠道）的清除更快，从而获得了显著更高的肿瘤与本底组织比值（如肿瘤/血液、肿瘤/肌肉比值）。与文献中报道的其他使用类似CGGG螯合剂但靶向肽序列不同的探针相比，[^99mTc]Tc-P1也展现出可比或更优的结合亲和力与靶向特异性。

这项研究的重要意义在于，它验证了将螯合功能直接整合到靶向肽序列中以构建一体化分子探针的可行性。这种肽基螯合剂策略不仅简化了合成步骤（在固相合成中一步完成），降低了成本，更重要的是，通过优化螯合序列（本研究证明CGGG最优），能够从根本上改善放射性探针的稳定性、亲和力和体内分布特性。[^99mTc]Tc-CGGG-rL-A9展现出的高稳定性、高特异性、良好的肿瘤摄取与对比度，使其成为一种具有潜力的新型HER2靶向SPECT显像剂候选分子，为HER2阳性乳腺癌的精准诊断和疗效评估提供了新的工具选项。