KTI蛋白家族的功能特征以及Populus simonii × P. nigra中的PsnKTI21在抵御Hyphantria cunea中的作用

《Plant Science》：Functional characterization of the KTI protein family and the role of PsnKTI21 from Populus simonii × P. nigra in defense against Hyphantria cunea

本研究鉴定出杨树基因组中的33个KTI基因，发现其通过抑制幼虫消化酶活性干扰营养吸收，其中PsnKTI21过表达使叶片损伤减少40%，并显著降低幼虫体重和死亡率。

　　

Jiahui Jiang | Zhanling Sun | Gaofeng Fan | Yingying Yu | Boru Zhou | Tingbo Jiang

中国哈尔滨东北林业大学树木遗传与育种国家重点实验室，邮编150040

摘要

昆虫的食草行为对植物生存和生态稳定性构成了严重威胁。Kunitz型蛋白酶抑制剂（KTIs）是一类重要的植物防御基因，参与植物对昆虫压力的响应。在本研究中，我们在杨树基因组中鉴定了33个KTI基因，这些基因在七条染色体上的分布不均。系统发育分析将这些蛋白质分为三个亚组，同一亚组的成员具有高度保守的基序组成和组织结构，表明其功能具有保守性。RNA-seq分析显示，Hyphantria cunea幼虫的取食显著上调了Populus simonii× P. nigra中15个PsnKTI基因的表达，其诱导水平比未受损植物高2至234倍。其中响应最强烈的基因PsnKTI21被选中进行进一步的功能表征。在转基因杨树中过表达PsnKTI21可减少昆虫取食造成的叶片损伤超过40%，并对H. cunea幼虫具有驱避作用。此外，PsnKTI21抑制了幼虫中参与胰蛋白酶产生、解毒和海藻糖代谢的基因表达，导致幼虫体重减轻78%，死亡率增加73%，从而增强了杨树的抗虫性。我们的发现阐明了KTI基因家族在杨树中的进化保守性，并突出了PsnKTI21在昆虫防御中的关键作用，为培育抗虫杨树品种提供了宝贵的遗传资源。

引言

Hyphantria cunea（鳞翅目：夜蛾科）是一种具有国际重要性的检疫害虫，原产于北美，现已在亚洲和欧洲广泛入侵。该物种的特点是分布广泛、食性多杂，并具有严重的破坏潜力（Lu et al., 2025, Maguire et al., 2025）。其幼虫群集取食植物叶片，能在短时间内迅速使宿主树木落叶。在严重侵害情况下，这种落叶会削弱树木的生长能力，最终可能导致树木死亡，因此这种害虫被称为“无烟之火”（Yang et al., 2016）。目前的研究识别出两种不同的生态型——红头型和黑头型，每种类型都表现出独特的生态适应能力。红头型主要分布在北美中部和南部，而黑头型则广泛分布于亚洲和欧洲。基于COUE框架和MaxEnt模型的预测表明，在未来气候条件下，这两种生态型可能会继续扩展到新的适宜栖息地（Pan et al., 2025）。此外，最近的研究表明，全球气温上升加速了H. cunea的发育和扩散速度，可能增加其爆发频率和严重程度（Bayram et al., 2025）。因此，建立有效的监测系统和开发环境可持续的控制策略已成为林业和农业综合害虫管理的紧迫任务。

通过引入编码细菌δ-内毒素、杀虫蛋白以及植物来源的防御因子（如凝集素和蛋白酶抑制剂）的基因，基因工程显著推动了抗虫作物的发展（Talakayala et al., 2020）。因此，利用基因工程培育抗H. cunea的植物品种已成为当前研究的主要焦点（Zhou et al., 2020）。用于增强抗虫性的基因主要来源于微生物（Movahedi et al., 2022）、动物（Chen et al., 2024）和植物。在植物来源的抗性基因中，研究最广泛的是那些编码凝集素（Vasconcelos and Oliveira, 2004）、淀粉酶抑制剂和蛋白酶抑制剂（Siregar et al., 2025）的基因。蛋白酶抑制剂（PIs）是一类能够抑制蛋白水解酶活性的小分子蛋白质（Katoch et al., 2024）。植物来源的蛋白酶抑制剂基因种类繁多且丰富，为培育抗虫作物提供了广泛的遗传资源（Volpicella et al., 2011）。根据目标蛋白酶的活性位点，PIs可分为四大类：丝氨酸蛋白酶抑制剂（SPIs）（Ye et al., 2023）、半胱氨酸蛋白酶抑制剂（CPIs）、天冬氨酸蛋白酶抑制剂（APIs）和金属蛋白酶抑制剂（MPIs）（Akbar et al., 2018）。此外，根据保守的结构域，SPIs还可以进一步分为多个家族，包括大豆Bowman-Birk胰蛋白酶抑制剂（BBTI）家族、马铃薯蛋白酶抑制剂I和II家族、RT I/Mt II家族、南瓜抑制剂家族、大豆Kunitz胰蛋白酶抑制剂（KTI）家族以及Serpin家族（Pandey et al., 2022）。

KTI家族是植物中最受研究和广泛应用的一类蛋白酶抑制剂。KTI蛋白通常由一条或两条多肽链组成，含有四个半胱氨酸残基，形成两个二硫键，并具有一个反应位点（Sultana et al., 2023）。它们的抗虫机制主要通过与昆虫肠道中的丝氨酸蛋白酶结合，从而抑制蛋白酶活性，干扰营养物质的消化和吸收，最终影响昆虫的生长、发育和代谢，在严重情况下甚至导致死亡（Guo et al., 2024, Sultana et al., 2022）。迄今为止，已在多种植物物种中鉴定并功能表征了KTI型蛋白酶抑制剂，包括Glycine max（Roy et al., 2018）、Solanum tuberosum（Wang et al., 2023）、Arabidopsis thaliana（Arnaiz et al., 2018）等。越来越多的证据表明，KTI基因在植物对生物胁迫的响应中起着重要作用。例如，以较高浓度（100μM和500μM）补充大豆SKTI可显著抑制棉铃象甲幼虫的体重增加，分别减少了约23%和60%的生长（Franco et al., 2004）。同样，过表达KTI7的转基因大豆植株在玉米螟侵害后表现出更高的存活率，并显著抑制了幼虫的生长（Sultana et al., 2023）。在A. thaliana中，已鉴定出七个KTI家族成员，其中AtKTI4和AtKTI5在Tetranychus urticae取食后被诱导；这些基因的敲除突变体比野生型植株的叶片损伤程度高1.2-1.5倍（Arnaiz et al., 2018）。

树木在长期进化过程中发展出了复杂的防御机制以应对生物胁迫（Joseph et al., 2025, Garosi et al., 2025）。杨树作为一种具有高经济和生态价值的森林物种，由于其相对紧凑的基因组而广泛用于遗传学研究（Borkhert et al., 2025）。然而，近年来，单一作物种植园的扩张和气候变化加剧了杨树面临的病虫害压力，其中H. cunea的破坏尤为严重。已知KTI基因家族在多种植物中介导抗食草反应，但其在杨树对抗H. cunea中的具体功能尚不清楚。在本研究中，我们结合RNA-seq数据和生物信息学分析，鉴定了受H. cunea取食强烈诱导的KTI基因。PsnKTI21表现出尤为显著的上调，表明其在杨树抗虫防御中起关键作用。为了验证这一假设，我们生成了过表达PsnKTI21的转基因杨树品系，并进行了选择性和非选择性取食实验。结果表明，PsnKTI21通过干扰昆虫的生理代谢来增强抗虫性，揭示了这一效应的潜在分子途径。研究结果阐明了PsnKTI21在杨树-昆虫相互作用中的分子功能，并为抗虫杨树品种的分子育种提供了理论基础和候选基因，同时为基于植物先天免疫的可持续害虫管理策略的开发提供了依据。

杨树中KTI蛋白的鉴定和理化性质

为了鉴定杨树中的KTI家族成员，我们从TAIR数据库（https://www.arabidopsis.org/）获取了AtKTI蛋白序列，并从Phytozome数据库（https://phytozome-next.jgi.doe.gov/）获取了Populus trichocarpa v3.1的基因组数据。首先，使用七个AtKTI蛋白序列作为查询，在P. trichocarpa基因组中进行了BLASTp搜索（E值< 1 × 10??）。其次，利用KTI家族的保守结构域模型（Pfam: PF00197）（Bendre et al., 2018）进行了进一步分析

杨树中KTI家族基因的结构分析

对杨树中KTI基因家族的全基因组调查鉴定了33个成员，根据它们的染色体位置分别命名为PtrKTI1至PtrKTI33（补充表S3）。为了进一步表征这一家族的结构特征，我们构建了系统发育树，并分析了基因结构、保守结构域和蛋白质基序组成。系统发育分析将这33个PtrKTI蛋白分为三个不同的亚组（图1）。基因结构分析表明

讨论

已知KTI基因家族在多种植物物种的生物胁迫防御中起着关键作用（Zhang et al., 2023, Fan et al., 2019, Arnaiz et al., 2018）。然而，其在杨树对抗主要害虫（如H. cunea）中的具体功能和分子机制仍很大程度上尚未探索。在本研究中，我们在杨树中鉴定了33个KTI基因，这一数量明显高于Major和Constabel在2008年报告的22个基因（Major & Constabel, 2008）。

结论

本研究在杨树基因组中共鉴定出33个KTI基因，这些基因分布在七条染色体和三个支架序列上。系统发育分析将这些基因分为三个不同的亚家族，同一亚家族的成员在基因结构上具有高度相似性。基因重复分析发现四对重复基因，包括一个串联重复和三个片段重复。转录组分析显示，15个PsnKTI基因

作者贡献信息

TBJ和BRZ设计了研究方案。JHJ和GFF进行了实验。YYY和ZLS提供了新的试剂或分析工具。JHJ和ZLS分析了数据。JHJ撰写了手稿。所有作者都阅读并批准了手稿。

利益冲突声明

所有作者声明没有竞争性财务利益。

未引用的参考文献

Zhou et al., (2021)

资助

本研究得到了农业生物育种重大项目（2022ZD0401504）的财政支持。

CRediT作者贡献声明

Boru Zhou：监督工作。Yingying Yu：正式分析。Tingbo Jiang：资金获取、概念构思。Jiahui Jiang：撰写——初稿、方法学、实验、正式分析。Gaofeng Fan：软件支持。Zhanling Sun：实验研究。

利益冲突声明

所有作者声明没有竞争性财务利益。