《Journal of Separation Science》：Multiple Heart-Cut Ion-Exchange Chromatography-Reversed-Phase Liquid Chromatography Platform for Online Desalting and Fractionation of Monoclonal Antibody Charge Variants
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为克服传统离子交换色谱（IEC）使用非挥发性盐阻碍质谱表征的难题，研究人员构建了一种在线、自动化的多中心切割IEC-RPLC平台，实现了单克隆抗体（mAb）电荷变体的分离、脱盐、浓缩与分馏，为生物药关键质量属性（CQAs）的深入表征提供了高效、高分辨率的解决方案。
在生物制药的世界里，单克隆抗体（mAb）这类“生物导弹”因其精准靶向疾病的能力而备受瞩目。然而，这些大分子蛋白质本身结构复杂，在生产过程中微小的偏差就可能产生结构修饰，形成不同的“电荷变体”。这些变体就像同一型号导弹的细微差别，可能影响其“飞行”的稳定性、精准度和最终“战斗力”（即药效和安全性）。因此，严密监控和表征这些电荷变体，是确保每一批生物药都安全有效、品质如一的关键。
目前，离子交换色谱（Ion-Exchange Chromatography, IEC）是分离和分析mAb电荷变体的主力工具。但它有一个“阿喀琉斯之踵”：为了有效洗脱蛋白质，流动相中通常含有高浓度的非挥发性盐（如MES、氯化钠）。这些盐就像一层“盔甲”，会严重干扰后续的质谱（Mass Spectrometry, MS）检测，而MS恰恰是深入解析蛋白质结构、糖基化等关键信息的“眼睛”。传统解决方案要么费时费力（如离线脱盐），要么仪器复杂、样品需求量大（如全二维液相色谱）。有没有一种方法，能像流水线一样，自动完成IEC分离、同时在线脱掉“盐盔甲”，并将纯净的电荷变体分门别类收集好，直接送去进行深度“体检”（如MS分析）呢？
这正是发表在《Journal of Separation Science》上的这项研究要解决的问题。研究人员开发了一个名为“IMPROBE”的集成化多维液相色谱平台，它巧妙地将IEC与反相液相色谱（Reversed-Phase Liquid Chromatography, RPLC）在线耦合，专门用于mAb电荷变体的分离、在线浓缩、脱盐和分馏。
为了开展这项研究，研究人员主要运用了以下几项关键技术方法：1. 多维液相色谱平台构建：利用一个单一的HPLC系统，整合两台泵、一个十通阀和一个六柱选择阀，构建了自动化的IEC-RPLC heart-cut工作流。2. 模型单抗样品分析：使用由Polpharma Biologics提供的治疗性单克隆抗体（mAb-1）作为模型样品。3. 离子交换色谱分离：采用强阳离子交换（SCX）柱，以含有非挥发性盐（MES/NaCl）的pH梯度分离mAb-1的电荷变体（酸性变体、主异构体、碱性变体）。4. 反相色谱在线脱盐与捕获优化：系统评估了两种RPLC捕获柱填料（C4和PLRP-S）的蛋白结合容量，并优化了上样条件（盐浓度、pH、温度）以最大化回收率。5. 质谱表征：将平台与四极杆飞行时间质谱（Q-TOF MS）联用，对脱盐后的电荷变体馏分进行完整蛋白质量数和糖基化谱分析。
研究结果
3.1 使用非挥发性盐通过IEC分离mAb电荷变体
研究人员首先使用强阳离子交换色谱，在含有20 mM MES和NaCl的梯度条件下，成功分离了mAb-1的电荷变体。色谱图清晰地显示了酸性变体（A）、主异构体（M）和碱性变体（B）的洗脱顺序。通过优化梯度陡度（1.1 mM NaCl/min）并在流动相中添加5%（v/v）乙腈，有效分离了这些变体，并确定了后续用于捕获的各馏分时间窗口。
3.2 基于RPLC捕获柱的IEC脱盐方法开发
本部分的核心是找到最佳的在线捕获与脱盐条件。1. 捕获柱填料筛选：通过前沿色谱分析比较了C4（300 ?）和PLRP-S（1000 ?）两种填料的蛋白结合能力。结果发现，尽管PLRP-S理论比表面积更低，但其更大的孔径（1000 ?）为像mAb这样的大分子提供了更好的可及性，因此其实际结合容量（4.32 mg BSA）远高于C4填料（1.61 mg），且背压更低、更耐用，故被选为后续实验材料。2. 捕获条件优化：系统研究了上样条件对mAb回收率的影响。发现高盐浓度（如250 mM NaCl）和较高的pH（5.7）会显著降低mAb在PLRP-S柱上的捕获效率。降低样品pH至3.0、提高柱温至60°C有助于改善回收率和峰形，但过高的温度（80°C）会导致蛋白降解。综合考虑后，选择60°C作为操作温度。经过优化，整个IEC-RPLC流程的总回收率约为49.1%。
3.3 开发用于捕获、脱盐和收集IEC馏分的方法
在优化捕获条件后，研究人员将IEC分离与完整的IMPROBE平台耦合。他们精细优化了三个关键延迟体积：IEC检测器到RPLC捕获柱的延迟（约15 μL）、RPLC洗脱条件（使用40%有机相一步洗脱）以及RPLC检测器到馏分收集器的延迟（80 μL）。利用该平台，他们成功从IEC分离中自动捕获、脱盐并收集了指定的电荷变体馏分（如A2, M, B1, B2）。每个馏分体积约为75 μL，相比原始的IEC馏分实现了1.3倍的富集，适合用于下游分析。
3.4 将IMPROBE平台与质谱联用
为了验证脱盐效果并对电荷变体进行深度表征，研究人员将平台与Q-TOF MS直接联用。脱盐过程有效，MS谱图中未见盐峰干扰。对酸性变体（A2）、主异构体（M）和碱性变体（B1）馏分的完整蛋白MS分析表明：1. 糖基化差异：酸性馏分A2中观察到了一糖基化和二糖基化的唾液酸化糖型（如G2F/G2FS1），而这些在主异构体M中未检测到，这可能是导致其电荷差异的原因之一。2. 碱性变体成因：碱性馏分B1中检测到不完全的C端赖氨酸切除（质量增加128 Da），这是生产过程中常见的修饰，会改变蛋白质净电荷，从而在IEC中表现为碱性变体。该结果直接证实了IEC分离的电荷变体具有不同的翻译后修饰特征。
结论与意义
本研究成功开发并验证了一个高效、自动化的“多中心切割IEC-RPLC”集成平台（IMPROBE）。该平台的核心价值在于解决了传统IEC使用非挥发性盐与后续MS表征不兼容的长期难题。通过系统优化RPLC捕获条件（特别是选用大孔径PLRP-S填料并控制上样pH与盐浓度），平台能够在单次分析中自动完成多达5个mAb电荷变体的IEC分离、在线脱盐、浓缩和分馏。
尽管当前体系在从高盐、近中性pH的IEC流动相中捕获mAb时回收率尚有提升空间（约49%），但它显著简化了工作流程，避免了繁琐的离线处理，并实现了样品的在线富集。更重要的是，收集到的脱盐馏分（约75 μL）可直接用于多种下游表征技术，如肽图分析（bottom-up）、亚基分析（middle-up）或生物活性测定，为全面剖析生物药的临界质量属性（Critical Quality Attributes, CQAs）打开了方便之门。
此项研究的意义不仅限于mAb的电荷变体分析。IMPROBE平台的设计理念具有普适性，可扩展至其他使用MS不兼容流动相的色谱模式，如疏水相互作用色谱（HIC）或尺寸排阻色谱（SEC），也可用于分析其他类型的生物制剂（如抗体偶联药物ADC）。它为生物制药领域提供了一种灵活、强大的工具，助力于更深入、更高效地理解和控制生物药的复杂性与异质性，最终服务于更安全、更有效的药物开发与生产。
