综述：CRISPR/Cas9基因组工程在非常规产油酵母中的应用、挑战与展望

《Yeast》：CRISPR/Cas9 Genome Engineering in Non-Conventional Oleaginous Yeasts: Applications, Challenges, and Prospects

这篇综述系统阐述了CRISPR/Cas9系统在产油酵母基因组编辑中的最新进展与核心挑战。文章聚焦于如何利用该技术（如sgRNA设计、Cas9递送）精准调控脂质代谢通路，以提升油脂产量、优化脂肪酸组成，并推动其在生物精炼与生物基化学品生产中的应用。文中详细比较了不同物种（如Rhodotorula toruloides、Cutaneotrichosporon oleaginosus）的编辑策略，也深刻剖析了当前面临的技术瓶颈（如转化效率低、PAM序列受限、DNA修复机制不明确），为未来开发更高效的通用型编辑平台提供了清晰的研究方向与前景展望。

　　

CRISPR/Cas9基因组工程在非常规产油酵母中的应用、挑战与展望

1 引言

微生物油脂是食品、能源、医药和化妆品行业的重要原料。其中，产油酵母因其生长速度快、脂质产率高、能利用多种碳源（包括木质纤维素水解糖）而备受关注，对发展可持续的生物精炼和循环生物经济至关重要。产油酵母的脂质主要是三酰甘油，富含C₁₆和C₁₈脂肪酸。其合成主要通过de novo（线粒体柠檬酸输出至胞质，经ATP-柠檬酸裂解酶^ACL作用）和ex novo（外源脂肪酸摄取）两条途径。

为最大化其工业潜力，针对脂质代谢关键酶的基因工程是核心手段。在众多基因编辑工具中，CRISPR/Cas9系统以其设计简单、效率高、可多重编辑的优势脱颖而出。该系统利用单向导RNA^sgRNA将Cas9核酸酶靶向目标基因，在原型间隔区相邻基序^PAM处产生双链断裂，进而通过细胞的非同源末端连接^NHEJ或同源定向修复^HDR机制实现基因敲除、插入或替换。

2 CRISPR/Cas9组件及其向靶细胞的递送

一个功能性的CRISPR/Cas9系统需要两个关键组件：sgRNA和Cas9核酸酶。将这些组件有效递送到酵母细胞中是成功编辑的第一步。常用方法包括：

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  质粒递送：将Cas9基因和sgRNA表达盒构建在整合型或附加体质粒上。
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  mRNA和蛋白质直接递送：直接转入Cas9 mRNA或预组装的Cas9核糖核蛋白复合体^RNP。
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  转化方法：电转、醋酸锂^LiAc法和根癌农杆菌介导的转化^ATMT是产油酵母中最常用的方法。

Cas9蛋白需要核定位信号^NLS才能进入细胞核发挥作用。DNA双链断裂后，细胞主要通过NHEJ和HDR进行修复。NHEJ通常引入随机插入或缺失，导致基因功能丧失；而HDR可利用外源DNA模板实现精确编辑。在多数非常规产油酵母中，NHEJ占主导地位，这为实现精确的HDR编辑带来了挑战。

3 CRISPR/Cas9在产油酵母中的应用

3.1 Cutaneotrichosporon oleaginosus

C. oleaginosus能积累高达细胞干重80%的脂质，且能耐受木质纤维素水解液中的抑制剂。近期研究建立了基于原生质球化的CRISPR/Cas9编辑方案，测试了Cas9 mRNA+sgRNA、RNP复合体及Cas9切口酶^nCas9等多种策略，成功敲除了 URA5基因。利用该系统对Δ-9和Δ-12去饱和酶基因^{D9FAD, D12FAD}进行过表达、启动子替换和敲除，有效调控了脂肪酸组成，例如增加饱和与单不饱和脂肪酸比例，展示了其在定制化油脂生产中的应用潜力。

3.2 Rhodotorula spp.

Rhodotorula toruloides是研究最深入的产油酵母之一，能同时高产油脂和类胡萝卜素。其CRISPR/Cas9平台发展迅速：

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  系统优化：早期工作通过密码子优化spCas9、使用内源tRNA或U6启动子驱动sgRNA，显著提高了编辑效率。例如，用内源tRNA^Phe启动子替代异源SNR52启动子，效率提升达14倍。
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  多重编辑：利用tRNA间隔的多sgRNA阵列实现了多基因同时敲除。
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  代谢工程应用：编辑策略被广泛用于：
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    增强脂质积累：敲除脂滴相关蛋白基因^{LDP1, CALS}或脂质分解基因^{ATG15, ACOX2}。
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    解析代谢网络：系统性敲除或过表达脂质代谢通路中16个关键基因（如^{ACC1, ACL1, DGA1, LRO1}），以理解其功能并组合优化提高脂肪酸产量。
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    生产高值化合物：用于生产三乙酸内酯、3-羟基丙酸、α-松油醇、麦角硫因等。

3.3 Candida spp.

在 Candida tropicalis等物种中，CRISPR技术已从基础编辑发展到精密的调控和代谢工程：

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  平台进化：采用内源tRNA启动子（如tRNA^Gly）构建tRNA:gRNA平台，实现了高效、通用的sgRNA表达。
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  CRISPR干扰^CRISPRi：使用催化失活的dCas9进行转录抑制，用于精细调控基因表达（如抑制^ERG9以增加β-胡萝卜素产量）。
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  异源途径构建：成功整合多个外源基因，实现了α-蓊草烯、西柏三烯醇^CBT-ol和角鲨烯等萜类化合物的高效生产。
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  物种拓展：在 Candida viswanathii中首次建立CRISPR/Cas9系统，通过共整合多个基因，使十二烷二酸产量翻倍。

4 在产油酵母中应用CRISPR/Cas9面临的挑战

尽管前景广阔，但在非常规产油酵母中建立高效CRISPR平台仍面临多重障碍：

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  低转化效率：厚而致密的细胞壁是主要物理屏障。原生质球转化是提高效率的有效方法。
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  组件表达困难：缺乏经过验证的强效内源启动子来驱动Cas9和sgRNA的高效、稳定表达。异源Cas9的密码子偏好性也可能影响其翻译。
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  PAM序列限制：SpCas9所需的NGG PAM序列在基因组中分布有限，限制了可靶向位点。需要探索PAM要求更宽松的Cas9变体。
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  DNA修复机制偏好：多数非常规产油酵母依赖NHEJ而非HDR，导致精确编辑（如基因插入或替换）效率低下。
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  分子工具匮乏：缺乏内源附加体质粒、自生染色体复制序列^ARS，以及物种特异的生物信息学工具和注释良好的基因组资源。

5 结论与展望

CRISPR/Cas9技术正深刻改变着产油酵母的代谢工程面貌。未来发展趋势包括：

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  系统优化与共享：开发跨物种兼容的通用型组件（如杂交启动子、基于保守tRNA的sgRNA表达系统），以加速在不同产油酵母中的应用部署。
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  工具多样化：引入Cas12a^Cpf1等其他Cas核酸酶及其衍生物（如dCas9用于CRISPRi/a），以丰富编辑和调控手段。
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  机制深入研究：进一步阐明不同产油酵母的DNA修复机制，并通过基因操作（如敲除^KU70/80）来促进HDR，提高编辑精确度。
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  应用范围拓展：将成熟的编辑策略推广至更多具有潜力的非常规产油酵母（如 Lipomycesspp.），充分挖掘其生物技术潜力。

通过克服当前挑战并融合多种工程策略，CRISPR/Cas9有望将产油酵母打造成更强大、更多元的细胞工厂，为可持续生物制造和绿色经济提供核心驱动力。