《Sensors and Actuators B: Chemical》：Spatiotemporal visualization of prolyl endopeptidase in living systems by an enzyme-activatable NIR fluorogenic probe
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近红外荧光探针ZGPB-DDAO成功实现帕金森病模型中PREP活性的高时空分辨率实时监测，揭示了区域特异性动态与疾病进展的强相关性。
魏桂林|张朝阳|王斌|金强|李晓东|金卓安|刘勇|邹立伟|葛光波
大连工业大学化学工程、海洋与生命科学学院，中国盘锦124221
摘要
脯氨酰内肽酶（PREP）通过促进有毒α-突触核蛋白的聚集，成为帕金森病（PD）的关键致病因素。因此，在活体系统中以高时空分辨率原位监测PREP的活性对于理解PD的进展至关重要。然而，现有的PREP荧光探针存在选择性差、时空分辨率不足以及无法有效穿透血脑屏障（BBB）的问题，这限制了它们在深层器官中的原位成像应用。在这里，我们报道了一种新型近红外荧光底物，可用于精确地原位可视化活体系统中的PREP活性。通过虚拟筛选和实验验证，ZGPB-DDAO被鉴定为一种优化的PREP底物，具有出色的选择性和灵敏度，能够特异性监测PREP活性水平，而不会与其他哺乳动物肽酶或水解酶发生交叉反应。ZGPB-DDAO随后被用于监测应激状态下活体细胞中的PREP活性水平，并且其对于已建立的PREP抑制剂KYP-2047的响应性也得到了确认。此外，ZGPB-DDAO能够在活体细胞、体外组织和体内模型中进行有效的抑制剂筛选和表征。最重要的是，ZGPB-DDAO成功用于PD小鼠中PREP活性的原位时空成像，揭示了区域PREP活性变化与疾病进展之间的强烈相关性。总体而言，这种新型NIR荧光工具为活体系统中PREP的原位功能成像提供了实用平台，有助于研究PREP在疾病中的关键作用，并加速发现有效的PREP抑制剂作为下一代抗PD疗法。
引言
脯氨酰内肽酶（PREP）是一种丝氨酸蛋白酶，以切割短神经活性肽而闻名，它在人类病理生理学中具有多方面的作用[1]、[2]。除了其经典功能外，越来越多的证据表明PREP与炎症过程之间存在密切联系。在多种肝炎和肺炎模型中，PREP的表达水平升高，而针对PREP的靶向抑制已被证明是缓解炎症疾病的有效策略[3]、[4]、[5]、[6]。鉴于PREP在大脑中的高表达水平，它因在神经炎症中的作用而受到广泛关注[7]，尤其是在神经退行性疾病背景下。PREP通过加速α-突触核蛋白（α-syn）的聚集，加剧了帕金森病（PD）等疾病的发病机制[8]，这是该疾病的一个关键病理特征。相反，对PREP的药物治疗可以减少寡聚体的形成并促进自噬[9]、[10]、[11]，这突显了其作为新型治疗靶点的潜力。
值得注意的是，PD中α-syn的病理变化遵循一种特定的时空模式，以阶段依赖的方式在特定脑区积累[12]。鉴于PREP在加速α-syn聚集中的作用，其在PD进展过程中的活性也可能表现出区域和阶段的特异性动态。因此，一种能够感知PREP活性水平的时空成像工具对于阐明其与疾病进展的相关性以及评估PREP调节剂的效果至关重要。传统的终点检测方法，如体外生化检测和免疫组化检测[13]，在监测大脑等深层器官中的这些动态变化时存在固有的局限性。相比之下，光学成像探针具有高灵敏度和出色的时空分辨率[14]、[15]、[16]、[17]，非常适合在活体系统中实时监测目标蛋白。尽管已经报道了一些用于PD相关生物标志物的比率荧光探针[18]、[19]、[20]、[21]、[22]，但酶激活型探针具有独特的优势，包括高目标特异性、通过酶促转化实现信号放大以及与内源性酶活性的直接关联[23]、[24]、[25]、[26]。然而，现有的PREP激活型荧光探针（如Z-Gly-Pro-AMC和Z-GP-ACM）存在一些关键缺陷，如发射波长短、量子产率低和选择性不足[27]、[28]。这些缺点共同限制了它们在器官或全身水平上进行实时体内成像的实用性。因此，开发一种优化的PREP光学探针对于阐明其在PD发病机制中的作用以及加速发现靶向抑制剂疗法至关重要。
作为S9丝氨酸蛋白酶家族的关键成员，PREP与其他脯氨酸特异性肽酶（包括成纤维细胞激活蛋白（FAP）和二肽基肽酶4（DPP4）[29]、[30]）在结构和催化机制上有显著的同源性。所有这些酶都具有保守的催化三联体，并且都具有切割含有脯氨酸的肽键的独特能力，从而能够处理包括神经肽和趋化因子在内的生物活性肽[31]、[32]、[33]。例如，FAP和DPP4表现出二肽基肽酶活性，并参与免疫调节和组织重塑[34]、[35]，而PREP则在脯氨酸下游水解寡肽，影响神经退行性疾病中的神经元信号传导和蛋白质聚集[36]、[37]。这种功能上的重叠使得设计选择性的PREP底物变得复杂。由于FAP和DPP4在病理情况下通常高表达，它们可能与PREP发生交叉反应，产生假阳性信号并影响实验结果的解读。因此，用于在大脑中空间和时间成像这种关键酶的PREP激活型探针的开发需要满足多个严格的标准。这些关键标准包括高选择性以最小化同源酶的干扰[38]、最佳的量子产率以实现敏感检测[39]、[40]、发射波长位于近红外（NIR）范围以实现深层组织穿透[41]，以及足够的血脑屏障（BBB）通透性以到达受PD病理影响的脑区。尽管我们的第一代PREP探针表现出优异的选择性，但其较低的量子产率最终限制了其在全身原位成像和体内实时追踪PREP活性的实用性，这突显了在大脑中实现高保真度时空映射的持续挑战。
为了克服这些限制，本研究旨在开发一种新型荧光探针，用于精确体内监测PREP并研究其在活体大脑中的时空动态。首先，我们采用了一种综合策略来合理设计PREP的荧光底物，该策略结合了多变量筛选。这一过程根据关键标准评估了候选荧光团，包括它们与PREP活性位点（Ser554）的空间接近性、BBB通透性和结合亲和力。这种方法鉴定出两种有前景的候选底物，随后通过体外实验进行了严格评估。优化的底物（ZGPB-DDAO）对PREP的选择性明显优于FAP、DPP4和其他肽酶。ZGPB-DDAO在从匀浆液到活细胞和小鼠大脑的范围内，都表现出出色的实时监测PREP活性的能力。此外，ZGPB-DDAO在体外和体内都表现出极高的特异性，使其适用于高通量、多尺度的抑制剂筛选。值得注意的是，这种探针首次实现了在整个生物体水平上对PREP的全面功能成像，揭示了PD小鼠大脑中PREP活性的区域特异性变化，并提供了对其在疾病进展中时空作用的全新见解（图1）。
监测PREP活性的通用程序
PREP活性在含有100 mM PBS（pH 7.4）、酶和探针ZGPB-DDAO的0.1 mL反应混合物中进行了检测。加入探针后，在37°C下摇动水浴中孵育30分钟，然后加入等体积的冰冻乙腈终止反应。荧光测量使用荧光微板读数器（SpectraMax? iD3，Molecular Devices，奥地利）进行，激发/发射波长分别为600/660 nm。为了并行分析，样品被...
针对PREP的特异性荧光底物的设计与合成
PREP是一种肽酶，能够切割脯氨酸残基羧端侧长度小于30个氨基酸的肽。Bunker A等人发现，氨基末端含有延长基团的二肽衍生物仅被FAP或PREP水解，这两种酶都具有内肽酶活性。这种选择性防止了DPP4、DPP8和DPP9等外肽酶的水解[42]。基于PREP的代谢特性和底物偏好，我们构建了一种...
结论
总结来说，我们开发了一种新型近红外荧光底物（ZGPB-DDAO），用于在小鼠大脑中高时空成像PREP。ZGPB-DDAO对PREP表现出优异的选择性，并能够在应激状态下的活细胞中实现实时活性监测。ZGPB-DDAO成功用于可视化各种组织中的PREP分布，尤其是在大脑中。此外，这种酶激活型荧光探针在高通量筛选中表现出良好的性能...
CRediT作者贡献声明
魏桂林：撰写——原始草案、方法学、研究、数据管理。张朝阳：方法学、数据管理。王斌：方法学、数据管理。金强：撰写——审稿与编辑、监督、资源获取、概念构思。李晓东：软件、数据管理。金卓安：方法学、数据管理。刘勇：撰写——审稿与编辑、监督、资源获取、概念构思。邹立伟：撰写——审稿与编辑、...
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的可能会影响本文所述工作的竞争性财务利益或个人关系。
致谢
本工作得到了国家自然科学基金（编号82274006和82474023）和上海市自然科学基金（编号23ZR1461100和24ZR1465100）的财政支持。
魏桂林于2022年毕业于上海中医药大学，获得中药学硕士学位。她目前在大连工业大学刘勇教授的指导下攻读博士学位。她的研究兴趣集中在基于酶的生物传感器的开发以及天然抑制剂的结构优化上。
