利用近红外荧光探针追踪铁死亡过程中线粒体粘度的动态变化

《Spectrochimica Acta Part A: Molecular and Biomolecular Spectroscopy》：Tracking the dynamic change of mitochondrial viscosity in ferroptosis via a NIR fluorescent probe

线粒体靶向近红外荧光探针Mito-VF开发及其在铁依赖性细胞死亡粘度监测中的应用。

　　

姜涛|刘天心|文欣|徐雄豪|徐培明|柳海英|范春华|尹朱英|卢正良

山东济南大学化学与化学工程学院，中国250022

摘要

铁死亡（Ferroptosis）是一种受调控的细胞死亡途径，与线粒体损伤密切相关。因此，追踪线粒体内粘度的变化对于早期识别与铁死亡相关的疾病非常重要。在这里，我们开发了一种线粒体定位的近红外荧光探针（Mito-VF），能够实时报告整个铁死亡过程中的粘度变化。Mito-VF基于供体-π-受体（D-π-A）结构构建，包含一个噻吩-氨基噻唑电子供体和一个喹啉盐受体。由于分子内的电荷转移（TICT）过程，Mito-VF的近红外发射对周围环境的粘度非常敏感。此外，该探针具有明显的斯托克斯位移（Stokes shift）和有效的线粒体靶向能力，能够在细胞中进行高对比度的荧光成像。利用活细胞显微镜，我们观察到在erastin诱导的铁死亡模型中线粒体粘度逐渐升高。随着铁死亡进程的推进，荧光信号呈时间和浓度依赖性增加。重要的是，给予ferrostatin-1可以逆转与粘度相关的信号变化，表明铁死亡可以通过恢复线粒体粘度来缓解。

引言

铁死亡是一种由铁驱动的受调控的细胞死亡途径，其分子特征和细胞表型与凋亡（apoptosis）、坏死（necrosis）和自噬（autophagy）不同[1]、[2]、[3]、[4]、[5]。越来越多的证据表明，铁死亡损伤与多种病理状况有关，如癌症、帕金森病（Parkinson's disease）、阿尔茨海默病（Alzheimer's disease）和心血管疾病（cardiovascular disorders）[6]、[7]、[8]、[9]、[10]。从机制上看，铁死亡通常是由于细胞抗氧化防御机制受损引起的，主要是谷胱甘肽（glutathione，GSH）耗尽和谷胱甘肽过氧化物酶4（glutathione peroxidase 4，GPX4）功能丧失，这导致膜脂质氧化失控并进而积累脂质过氧化物[11]、[12]、[13]、[14]、[15]、[16]、[17]。脂质过氧化是铁死亡发生的直接生化指标。因此，能够在完整生物系统中实时、选择性地追踪这一过程的分析策略对于阐明其机制和病理意义至关重要。

线粒体作为细胞能量代谢、信号转导和氧化还原稳态的中心，发挥着不可或缺的作用[18]、[19]、[20]、[21]。在铁死亡过程中，这些细胞器常常会发生结构变化，如体积减小、膜密度增加以及嵴结构破坏[22]、[23]。线粒体局部粘度是一个关键的物理参数，它调节分子运输和网络动态，从而成为微环境变化的重要指标。异常的线粒体粘度与多种疾病状态有关，并可能通过限制代谢物的移动性而加剧细胞损伤[24]、[25]、[26]。因此，开发能够特异性监测线粒体粘度动态变化的工具对于深入理解线粒体在铁死亡中的作用至关重要。

传统的粘度测量方法，如毛细管粘度计、落球粘度计或旋转粘度计，仅适用于宏观流体，无法用于监测线粒体微环境中的粘度。相比之下，基于荧光的成像技术能够提供细胞内物理参数的实用读数，因为它可以实现灵敏、干扰最小的测量，并具有时空精度，可用于活体系统的实时观察[22]、[27]、[28]。粘度敏感探针的传感机制通常依赖于TICT过程。在低粘度环境中，探针的分子内化学键可以自由旋转，使分子进入TICT状态，导致荧光信号极弱或完全淬灭。相反，当粘度增加时，这种分子内旋转受到严格的空间限制，TICT非辐射途径被有效抑制，从而显著增强荧光强度。迄今为止，已经开发了几种线粒体定位的荧光探针来高精度监测粘度波动。例如，Zan等人报道了一种双通道设计，可以在癫痫和铁死亡相关模型中同时监测ONOO^?和粘度[29]。Zheng及其同事开发了一种用于成像糖尿病肾病相关粘度变化的线粒体靶向传感器[30]。Wang等人设计了一种双靶向荧光寿命探针，用于揭示关节炎组织中的粘度异质性[31]。然而，大多数现有探针仍受限于较小的斯托克斯位移、环境极性干扰或光稳定性差的问题。

基于这些考虑，我们构建了一种线粒体定位的近红外荧光探针Mito-VF。该探针以噻吩-氨基噻唑部分作为电子供体，喹啉盐作为电子受体（方案1）。这种供体-受体结构赋予Mito-VF优异的线粒体靶向能力和高度敏感的粘度响应TICT机制[32]、[33]、[34]。此外，Mito-VF显示出强烈的近红外荧光和139纳米的斯托克斯位移，有助于减少多色成像实验中的光谱串扰。

细胞实验表明，Mito-VF通过静电相互作用定位于正常细胞的线粒体中，并在Monensin（Mon）和Nystatin（Nys）刺激下可靠地监测线粒体粘度的变化。利用Mito-VF，我们进一步阐明了erastin诱导的铁死亡与线粒体粘度增加之间的关联。通过精确控制erastin浓度、诱导时间和病理模型的修复，Mito-VF被证明是准确检测铁死亡过程中线粒体粘度动态变化的可靠工具。

部分摘要片段

Mito-VF的合成

将ATT-CHO（0.25克，1.19毫摩尔）、化合物1（0.41克，1.55毫摩尔）和哌啶（0.041克，0.48毫摩尔）加入15毫升的乙醇（EtOH）中，于85°C下回流。通过TLC监测反应完成后，停止加热并自然冷却至25°C。然后在真空条件下去除溶剂，通过柱层析（MeOH/DCM = 1:7，v/v）纯化粗产物，得到黑色固体（0.26克，产率67%）。¹H NMR（400 MHz，DMSO-d₆）δ 8.94（d，J = 6.7 Hz，1H）

探针的设计与合成

在这项工作中，我们旨在开发一种新型单分子荧光探针，通过监测线粒体粘度的变化来特异性追踪细胞铁死亡。为实现这一目标，探针必须满足几个关键要求：（1）高效的线粒体靶向能力，因为线粒体是铁死亡过程中脂质过氧化的主要发生部位；（2）对粘度变化具有高度敏感和选择性的荧光“开启”响应；（3）具有近红外发射特性

结论

在这项工作中，我们介绍了Mito-VF，这是一种基于D-π-A结构的近红外荧光探针，用于评估铁死亡过程中的线粒体粘度。该探针表现出粘度激活的（“开启”）响应，并具有高效的线粒体积累能力，支持高对比度的活细胞测量。在erastin处理的细胞中，Mito-VF能够捕捉到线粒体粘度的升高，其荧光变化趋势与铁死亡进程紧密相关。

CRediT作者贡献声明

姜涛：撰写——原始草稿、验证、数据分析、概念化。刘天心：方法学、数据分析、数据管理。文欣：方法学、数据分析、数据管理。徐雄豪：软件开发、数据分析、数据管理。徐培明：方法学、数据分析。柳海英：验证、方法学、数据分析。范春华：撰写——审稿与编辑、资金获取。尹朱英：撰写——审稿与编辑、监督、资金提供

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文的研究结果。

致谢

本工作得到了山东省自然科学基金（ZR2019MB040和ZR2023MF054）以及济南大学的研究项目（XKY1823、XKY2007和XBS1320）的财政支持。J.Y.感谢韩国国家研究基金会（NRF）通过韩国科学技术信息通信部（MSIT）资助的纳米与材料技术开发计划（RS-2024–00407093）以及韩国政府资助的韩国国家研究基金会（NRF）项目（RS-2023–00217701）的支持。