转录组分析揭示了萜类化合物生物合成途径的特征，并在Freesia × hybrida中发现了两个TPS-b基因

《South African Journal of Botany》：Transcriptome analysis revealed the characteristics of the terpenoid biosynthesis pathways and discovered two TPS-b genes in Freesia × hybrida

单萜烯合成途径及关键基因鉴定研究揭示Freesia × hybrida花期VOCs动态变化，通过RNA-Seq与SMRT测序发现MEP途径基因FhDXS1、FhIPI1及TPS-b亚家族基因FhTPS9、FhTPS10表达丰度与单萜烯释放显著正相关，为郁金香芳香育种提供理论依据。

　　

翁世丹|傅学青|李书|高宇|李东石|唐东琴

上海交通大学设计学院，中国上海200240

摘要

Freesia × hybrida是一种全球广泛栽培的著名切花，其特点在于能够释放大量挥发性有机化合物（VOCs）。本研究结果显示，随着开花过程的进行，VOCs的总量相对含量逐渐增加，在五个F. × hybrida品种中，单萜类化合物是最主要的萜类物质。从S1到S4阶段，CA、RP、GR、WR和PP品种中的单萜类化合物比例分别增加了1.55倍、10.17倍、5.63倍、3.50倍和14.69倍。随后通过RNA-Seq结合SMRT测序技术进行了转录组分析，以探讨萜类物质生物合成途径的特征。差异表达分析表明，参与MEP途径的关键基因表达水平显著高于MVA途径相关基因，这与单萜类化合物的高排放量密切相关。FhDXS1和FhIPI1被鉴定为MEP途径中的关键基因。通过RNA-Seq结合SMRT-Seq技术筛选出两个候选萜类合成酶（TPS）基因FhTPS9和FhTPS10，它们属于TPS-b亚家族。这两个基因的表达模式显示，在开花过程中先增加后减少。FhTPS9从S0到S2阶段的表达量增加了近50倍，FhTPS10从S0到S3阶段的表达量增加了900倍。亚细胞定位结果显示，FhTPS9和FhTPS10均位于质体中，与其他TPS-b亚家族成员一致。FhTPS9和FhTPS10的表达谱与单萜类化合物的释放模式高度吻合。总之，我们的研究结果为F. × hybrida的香气生物合成机制提供了理论基础，并为未来改良Freesia的香气特性奠定了基础。

引言

萜类化合物是植物花香物质中最大的一类，也是数量最多、结构最多样化的次生代谢物（Muhlemann等，2014）。Kekule首次提出“Terpene”一词来描述松节油中的碳氢化合物C₁₀H₁₈，其中“ene”表示该化合物中的烯键（Dev，1989），后来该术语被用来指代以异戊二烯（C₅H₈）为基本结构单元的一类天然产物及其衍生物（Dev，1989）。单萜类及其衍生物通常具有香气，而倍半萜类则以酮、醇和内酯的形式存在于植物的挥发性成分中。由于分子量低、沸点低且具有香气，这两种物质是植物花香的主要成分（Dev，1989）。例如，Rosa × hybrida的独特甜香气主要由单萜类化合物组成，包括香叶醇（C??H??O，反式-）、香茅醇（C??H??O）和橙花醇（C??H??O，顺式-）（Véronique等，2007）。从10个茶香玫瑰（Rosa sp.）品种中鉴定出86种VOCs，其中萜类化合物离子酮（C??H??O）对该品种的特殊茶香起着重要作用（Zhou等，2020）。东方百合的强烈香气源于单萜类和苯环化合物的共同作用（Kong等，2017）。Cananga odorata var. fruticosa的花香成分主要是倍半萜类，包括α-法尼烯、α-bergamotene、germanthene和β-石竹烯（Jin等，2015）。观赏花卉释放的芳香萜类化合物显著提升了其观赏价值和商业价值。例如，Polianthes tuberosa被大规模商业化种植用于切花和花瓶装饰（Saborni和Adinpunya，2017）。从花瓣中提取的萜类精油也是香料和香水领域的重要化工原料，例如Cananga odorata var. fruticosa的花精油可用作香水原料。

萜类化合物的合成受到合成途径上游结构基因和下游萜类合成酶的共同影响。甲基乙二醇4-磷酸（MEP）途径和甲瓦龙酸（MVA）途径中上游结构基因的表达水平决定了花香中单萜类和倍半萜类的总含量，而途径末端的萜类合成酶则决定了具体化合物的类型及其产量。在自然界中，萜类化合物的合成可分为三个阶段：C5初始前体的合成阶段、直接前体的合成阶段以及萜类的合成和修饰阶段（Jiang等，2016）。所有萜类化合物都来源于异戊二烯二磷酸（IPP）及其异构体二甲基烯丙基二磷酸（DMAPP），它们是萜类的基本结构单元（Muhlemann等，2014）。在植物中，C5结构前体的合成通过两条独立的途径进行：MEP途径或MVA途径，分别发生在不同的亚细胞区室中（Beck等，2013）。MEP途径发生在质体中，包含七个生物合成步骤（Hsieh等，2008）；而MVA途径则发生在细胞质、内质网和过氧化物酶体中，涉及六个酶促反应（Dudareva等，2005）。在第二阶段，MEP途径和MVA途径产生的IPP和DMAPP按不同摩尔比例缩合，形成不同萜类的直接前体（GPP、FPP和GGPP）（Newman和Chappell，1999）。在第三阶段，萜类的直接前体（GPP、FPP和GGPP）在萜类合成酶（TPS）的作用下形成萜类的基本骨架。萜类的骨架进一步经过环氧化、异构化、糖基化、羟基化和酰基化等修饰反应，最终形成各种萜类及其衍生物（Sun等，2017）。

萜类合成酶（TPS）是负责萜类化合物生物合成的关键酶，在植物生长发育中起着重要作用。根据基因结构，TPS可分为三类：I类、II类和III类（Wang等，2019）。根据系统发育关系，TPS基因可分为七个亚家族：TPS-a、TPS-b、TPS-c、TPS-d、TPS-e/f、TPS-g和TPS-h，这些亚家族已在某些观赏植物中被报道，如金鱼草、Dendrobium officinale、Chimonanthus praecox和Camellia brevistyla等（Dudareva等，2003；Hattan等，2016；Shang，2020；Yu等，2020）。此外，一些观赏植物中还报道了与花香调节相关的TPS基因表达谱。例如，LiTPS2参与单萜类的生成，并能有效调节Lilium的香气（Zhang等，2020）。HcTPS7和HcTPS8参与Hedychium coronarium花朵中萨宾烯和芳樟醇的生物合成（Yue等，2014）。同样，在Jasminum sambac的花瓣中，发现芳樟醇的释放与JsTPS的表达有关（Bera等，2017）。

某些TPS酶仅负责合成一种萜类化合物，而大多数TPS酶具有催化多样性，即能够催化多种底物生成多种萜类化合物，这类酶通常以其合成的主要化合物命名。例如，在Perilla frutescens中，一种单萜类合成酶能催化53.8%的香叶烯、19.8%的芳樟醇、20.9%的萨宾烯和5.5%的柠檬烯的生成，因此被命名为香叶烯合成酶（Hyatt和Croteau，2005）。TPS的催化还具有底物多样性，即可以作用于不同底物生成多种萜类化合物。例如，葡萄中的TPS-g亚家族合成酶在体外实验中可以同时催化GPP和FPP两种底物生成挥发性单萜类化合物芳樟醇和橙花醇，但最终产物类型取决于葡萄中TPS的亚细胞定位（Zhu等，2014）。此外，植物中的TPS具有高度保守性，同一物种内的TPS序列相似性很高，但序列相似性与催化产物之间并无必然联系（Degenhardt等，2009）。例如，Perilla frutescens中的香叶烯合成酶和柠檬烯合成酶的序列相似度超过90%，但它们催化的不同单萜类产物不同（Hyatt和Croteau，2005）。因此，需要进一步鉴定特定TPS的功能，以确定不同物种花香中的具体产物。

现代Freesia植物通常指的是Freesia属内的园艺品种，即Freesia × hybrida。它们是Freesia植物的主要商业应用形式，丰富的花香是其显著特征。多项研究表明，Freesia花朵中的主要挥发性萜类化合物是单萜类和倍半萜类，其中单萜类尤为重要，尤其是芳樟醇。然而，不同品种之间的成分和含量存在差异（Harada和Mihara，1984；Fu等，2007；Lin等，2016；Yang等，2010；Weng等，2021）。近年来，利用转录组技术，学者们分析了某些Freesia品种的萜类代谢途径中的关键基因。通过鉴定特定品种的TPS家族成员，发现不同TPS属于不同的亚家族。进一步研究某些TPS的表达模式和功能表明，它们在不同品种中的表达不同，可能催化不同的最终代谢物（Huang等，2018；Gao等，2018；Li，2017；Aparna等，2020）。此前通过对34个Freesia种质的VOCs分析，我们发现有些品种以芳樟醇为主，但也存在多组分类型。品种间的成分和相对含量存在差异，这与花香的形成密切相关。在本研究中，我们结合SMRT转录组和RNA Seq转录组技术，对一个多组分品种进行了全长度转录组测序，以获得更全面的转录组数据，并对成分有显著差异的几个品种进行了RNA-Seq测序，以筛选萜类代谢途径中的差异表达基因，进而探讨候选TPS基因。本研究的目的是为全面分析Freesia × hybrida花朵中的萜类代谢模式提供科学依据，并为Freesia的未来育种提供新的遗传资源。

研究片段

植物材料

根据我们之前的研究，Freesia × hybrida的花香可根据不同的VOC组成分为以芳樟醇为主的类型和多组分类型。本研究中选择了五个代表性品种作为材料，包括四个以芳樟醇为主的品种：'Red Passion'（简称RP）、'Castor'（CA）、'Gold River'（GR）和'White River'（WR），以及一个多组分品种'Pink Passion'（PP）。

五种Freesia品种的VOC排放

根据花朵发育阶段（Spikman，1985；Liu，2014），Freesia花朵从绿色花蕾到枯萎可分为六个阶段，分别命名为S0至S5（表1）。

通过HS-SPME-GC-MS技术鉴定了Freesia花瓣中的VOCs，详细的VOC化合物见补充表S2。所有VOC化合物被分为三类：单萜类、倍半萜类和脂肪酸衍生物。

在上述五个品种中，VOCs的总量相对含量均有所增加

MEP途径中关键基因的高表达水平可能是Freesia花朵中单萜类高排放的重要原因

已有研究表明，MEP和MVA途径中上游结构基因的表达水平决定了花香中单萜类和倍半萜类的含量，而途径末端的萜类合成酶（TPS）则决定了具体化合物及其排放量（Dudareva等，2005）。在本研究中，通过转录组分析发现Freesia中MEP途径的基因数量远多于MVA途径。MEP途径相关基因的表达水平...

资助

本研究得到了上海农业研究体系、上海市农业委员会（资助编号：202508）的支持

CRediT作者贡献声明

翁世丹：撰写——原始草稿、软件使用、资源获取、数据分析、正式分析、数据管理。傅学青：撰写——审稿与编辑、数据可视化、方法学设计、概念构思。李书：撰写——原始草稿、软件使用、数据分析、数据管理。高宇：方法学设计。李东石：资源获取。唐东琴：撰写——审稿与编辑、数据可视化、资金申请、概念构思。

利益冲突声明

本手稿的提交过程中不存在利益冲突。我们确认本研究具有原创性，未曾在其他地方发表，也未在提交时处于审稿阶段。所有作者同意将本文独家提交给《Plant Physiology and Biochemistry》期刊。