《Nature Communications》：Sequential sequencing reveals the architecture and complexity of genomic variants in patients with Alport syndrome
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本研究针对Alport综合征（AS）致病基因变异解析难题，研究人员在555名中国患者队列中实施了序贯测序策略，成功识别了431种不同变异，揭示了大量新型及非编码变异，并借助纳米孔长读长测序（NLR-seq）发现了内含子大插入和复杂重复-倒位等新型结构变异，为深入理解AS遗传基础及提升遗传病诊断率提供了新见解与研究范式。
肾脏是人体内精密的“污水处理厂”，负责过滤血液、排出废物。然而，有一种名为Alport综合征（Alport syndrome, AS）的遗传性肾病，会悄然破坏肾脏的过滤结构，最终导致肾功能衰竭。AS是一种相对常见的遗传性肾病，主要由编码IV型胶原蛋白α链的COL4A3、COL4A4和COL4A5这三个基因发生突变引起。这些基因的产物是构成肾脏基底膜的关键“建筑材料”，一旦“建筑材料”出现问题，基底膜就会变得脆弱、断裂，失去过滤功能。
尽管已知AS与这三个基因相关，但在临床诊断中，仍有相当一部分患者无法通过常规的基因检测方法找到确切的致病突变。这就像在茫茫人海中寻找几个特定的罪犯，但手中只有模糊的照片和有限的线索。这些“隐藏”的突变可能位于基因的非编码区域（不直接指导蛋白质合成的部分），也可能是一些常规测序难以捕捉的大型或复杂的结构变异。这种“诊断缺口”阻碍了患者的精准诊断、遗传咨询和未来的靶向治疗。为了更全面地绘制AS的“遗传地形图”，揭开那些隐藏变异的神秘面纱，一个由中国研究人员领衔的团队开展了一项深入的研究，他们的成果最终发表在《Nature Communications》期刊上。
为了系统性地探究AS的遗传变异全貌，研究人员设计了一套严谨的“序贯测序”策略。他们首先对一个包含555名中国AS患者的队列进行了全外显子组测序（Whole-exome sequencing, WES），即对基因组中所有编码蛋白质的区域进行测序。对于WES未发现明确致病变异的患者，研究人员又进一步采用了三种更高阶的测序技术进行“追查”：全基因组测序（Whole-genome sequencing, WGS，可覆盖非编码区）、RNA测序（RNA sequencing, RNA-seq，可分析基因表达及剪接异常）和纳米孔长读长测序（Nanopore long-read sequencing, NLR-seq，擅长解析长片段序列和复杂结构变异）。通过这种从“广筛”到“精查”的递进式策略，力求不遗漏任何潜在的致病线索。
研究结果
1. 序贯测序策略大幅提高变异检出率
通过对555名患者进行WES，研究人员在509名（91.7%）患者中鉴定出431种不同的致病或可能致病变异。值得注意的是，其中高达42.2%（182种）的变异是此前从未被报道过的新发变异。这凸显了在中国人群中开展大规模基因测序研究对于发现群体特异性变异的重要性。仅靠WES，就已经将诊断率提升到了一个很高的水平。
2. 高阶测序技术破解“疑难杂症”
在WES未能找到答案的病例中，后续的WGS、RNA-seq和NLR-seq发挥了关键作用，成功为另外23名患者找到了“元凶”。这些被常规方法遗漏的变异主要分为几种类型：位于基因非编码调控区域的变异、涉及大片段DNA缺失或重复的拷贝数变异，以及结构复杂的染色体重排。这一结果表明，对于临床上怀疑为AS但WES阴性的患者，采用多组学结合的深度测序是必要的。
3. 非编码变异贡献显著且具种族特异性
本研究发现，非编码变异在AS患者中占有不可忽视的比例，占所有检测到变异的16.2%。更深入的分析显示，这些非编码变异的突变模式和热点区域在不同种族人群（如中国人与欧洲人）中存在差异，即具有“种族特异性”的突变模式。这提示我们，在构建遗传诊断数据库和设计检测试剂盒时，必须考虑到人群背景，不能直接套用其他人群的数据。
4. 长读长测序揭示新型结构变异
本研究最引人注目的发现之一，是利用纳米孔长读长测序技术（NLR-seq）发现了两种以前在AS中未被报道过的、复杂的新型结构变异。第一种是位于基因内含子区域的大型DNA序列插入。第二种是更为复杂的“重复-倒位”变异，即一段DNA序列不仅被重复复制，其中一份拷贝的方向还发生了倒转。这些复杂的变异结构如同基因组中打结的绳索，是短读长测序技术难以甚至无法准确解析的。NLR-seq凭借其超长的读长优势，直接“看清”了这些复杂变异的完整结构和精确位置。
结论与意义
本研究通过在中国AS患者队列中实施系统性的序贯测序策略，极大地深化了我们对AS遗传架构复杂性的认知。研究不仅证实了COL4A3、COL4A4和COL4A5基因的编码区突变是AS的主要病因，还首次系统性地揭示了中国AS患者中非编码变异的显著贡献及其种族特异性模式。更重要的是，研究借助前沿的纳米孔长读长测序技术，发现了内含子大插入和复杂重复-倒位等新型结构变异，这些发现突破了传统测序方法的检测边界。
这项研究的意义重大。在理论上，它提供了关于AS遗传异质性和变异频谱更全面、更深入的图谱，推动了人类对单基因病遗传基础的理解。在临床实践上，它有力地证明，结合WES、WGS、RNA-seq和长读长测序的序贯或多组学整合策略，能有效解决遗传病诊断中的“疑难杂症”，将诊断率推向新的高度，为患者提供更精准的分子诊断。同时，研究强调的人群特异性变异数据，为开发适合中国人群的遗传检测panel和优化诊断流程提供了关键依据。最终，该研究不仅为Alport综合征，也为其他遗传性疾病的基因诊断研究提供了一个可借鉴的、高效的研究范式。
