《npj Biomedical Innovations》：Use of in vitro co-culture models to inform bacterial engineering for the treatment of solid tumours
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这篇综述聚焦于工程化活菌疗法 (LBT) 在实体瘤治疗中的应用挑战与机遇。文章指出，尽管“智能菌”在临床前模型中展现出潜力，但其临床转化效果有限。为了克服这一瓶颈，作者系统阐述了多种体外共培养模型（如直接混合、Transwell、微流控、类器官等）的关键特征与应用。这些模型能够模拟复杂的肿瘤微环境 (TME)，用于研究细菌行为、筛选工程菌株、评估抗肿瘤效力，从而为合理设计更安全有效的抗癌细菌疗法提供关键见解，有望成为连接实验室研究与临床试验的重要桥梁。
癌症是全球主要的死亡原因，到2050年，预计每五个人中就有一人可能在一生中患癌。当前，实体瘤的标准疗法（手术、化疗、放疗）虽有一定效果，但也存在副作用、损伤健康细胞及产生耐药性等问题。一种充满前景的策略是利用工程化活菌疗法 (Live Bacterial Therapeutics, LBTs)。这些“智能菌”能够利用其天然倾向，选择性地在实体瘤的缺氧、免疫豁免的肿瘤微环境 (Tumor Microenvironment, TME) 中定植，并通过合成生物学手段进行改造，在肿瘤局部原位合成并释放抗肿瘤有效载荷（如纳米抗体、毒素、免疫调节剂等），从而实现精准的靶向治疗。
尽管临床前研究（如使用小鼠模型）显示工程菌能有效检测肿瘤或减小瘤负荷，甚至与化疗联用实现肿瘤完全消退，但仅有少数进入临床试验，且在人体的疗效有限。这种“转化鸿沟”部分归因于临床前研究设计的局限性以及动物模型与人类生物学之间的差异。因此，在进入耗时、昂贵且存在伦理问题的动物实验和临床试验之前，迫切需要改进细菌疗法的筛选和预测方法。
体外共培养模型作为一种强大的工具应运而生。它是一个受控的体外系统，用于研究两个或多个细胞群体（此处指真核细胞<如癌细胞>与原核细胞<如细菌>）如何相互作用并影响彼此。
共培养模型的主要类型与应用
不同类型的共培养模型各有其优势和适用场景，可用于回答不同的生物学问题。
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直接混合
这是最简单直接的模型，将细菌与癌细胞（二维细胞系、三维肿瘤球或类器官）在同一个培养体系中混合，使其直接接触。例如，将工程化沙门氏菌 (Salmonella typhimurium) 与结直肠癌细胞系共培养，可评估细菌递送短发夹RNA (shRNA) 靶向癌基因MYC 的效果。利用肿瘤球与细菌共培养，可以进行长达数天的细菌定植行为分析。而使用患者来源的结直肠癌 (Colorectal Cancer, CRC) 类器官与细菌共培养，则能更真实地模拟人体内的肿瘤-细菌相互作用，甚至用于研究细菌如何影响免疫检查点抑制剂 (如抗PD-1) 的疗效。
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Transwell
Transwell模型通过多孔膜将培养孔分隔为上（顶侧）、下（基底侧）两个腔室，允许营养物质和可溶性因子（如细菌分泌的毒素）通过，但阻止细胞直接迁移。这非常适合研究可扩散化合物的作用。例如，将能产生活性代谢物一氧化氮 (Nitric Oxide, NO) 的工程化大肠杆菌 (Escherichia coli) 与乳腺癌细胞分置于Transwell的两侧，可以评估NO扩散对癌细胞活力的杀伤作用，而无需细菌与癌细胞直接接触。
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微流控
微流控芯片能够创建更复杂、可控的微环境，常包含流体通道和多个由多孔膜分隔的腔室。例如，在一个微流控装置中，将工程化沙门氏菌与宫颈癌细胞HeLa 分别置于不同腔室，可以实时观察并验证细菌通过同步裂解回路 (Synchronized Lysis Circuit) 周期性地释放细胞毒素溶血素E (Haemolysin E)，从而持续杀死癌细胞的过程。
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类器官微注射与“顶出”类器官
对于肠道等具有腔道结构的类器官，其上皮细胞的顶侧（面向管腔）是细菌天然相互作用的界面。通过微注射技术将细菌注入类器官腔腔内，可以模拟这种生理相互作用。这种方法被成功用于研究某些大肠杆菌产生的基因毒素colibactin 对肠上皮细胞DNA造成的长期突变特征。另一种方法是使用“顶出”类器官，其上皮极性反转，顶侧朝外，便于细菌直接接触，从而更易于研究细菌的入侵机制。
共培养的条件、时长与结果读取策略
成功的共培养需要考虑诸多因素。为防止细菌过度生长消耗养分，可能需要通过基因工程（如同步裂解）、添加限制性抗生素（如庆大霉素 (gentamycin)）或使用酶清除胞外菌等方式进行控制。培养时长从数小时到数天不等，取决于细胞类型和实验目的。对于厌氧菌，需解决其缺氧需求与真核细胞需氧需求之间的矛盾，可使用特殊设计的Transwell（基底侧常氧，顶侧缺氧）或能建立氧梯度的“肠道芯片”模型。
常用的结果读取方法包括菌落形成单位 (Colony Forming Unit, CFU) 计数、荧光标记与活细胞成像、RNA/DNA测序以及代谢组学分析等。选择合适的方法并了解其局限性（如荧光强度受环境影响、CFU计数无法区分单个细菌与细菌团块）至关重要。
案例研究：利用共培养指导大肠杆菌Nissle 1917 (EcN) 的工程化
大肠杆菌Nissle 1917 (EcN) 是一种益生菌，因其能选择性定植肿瘤、基因组明确且安全性较好，常被用作LBT的底盘细胞。
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探究colibactin诱导的DNA损伤：通过将产colibactin的EcN与癌细胞直接共培养，可以评估细菌粘附及诱导DNA损伤的能力。更精细的研究则通过将EcN微注射入人肠道类器官腔腔，进行长期共培养和全基因组测序，揭示了由colibactin引起的特征性DNA突变模式，这些突变在人类CRC样本中也得到验证，从而明确了此类细菌在CRC病因学中的作用。
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为动物及临床试验提供有价值的前期信息：在将工程化EcN菌株SYNB1891 推进至动物和临床试验前，研究人员将其与永生化的小鼠或人抗原呈递细胞 (Antigen Presenting Cells, APCs) 进行直接共培养。该菌株被设计用于激活APC内的STING (STimulator of INterferon Genes) 通路。共培养实验证实，SYNB1891能以剂量依赖的方式显著诱导APC释放I型干扰素 (Type 1 Interferon, IFN)。这些体外结果为其后续在黑色素瘤小鼠模型中展现出的抗肿瘤效果及成功进入I期临床试验奠定了基础。
共培养模型的评估、挑战与未来方向
尽管体外共培养模型前景广阔，但其局限性也需正视以提升LBT的转化潜力。
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向临床应用的转化：临床前研究通常旨在减少变量，而真实患者存在巨大的遗传、生理和环境差异。使用患者来源类器官 (Patient-Derived Organoids, PDOs) 进行共培养，能更好地模拟患者特异性反应，是连接临床前与临床研究的有力平台。然而，PDO的培养成本高、耗时长，且其生长速率存在供体间差异。此外，LBT作为生物制剂，其规模化生产、遗传稳定性、生物安全防控、有效载荷的靶向递送以及潜在的水平基因转移 (Horizontal Gene Transfer) 等问题都需要在研发早期予以充分考虑。
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肿瘤微环境的异质性：标准的体外模型通常较为简化，而体内TME是一个包含癌细胞、免疫细胞、成纤维细胞、血管和细胞外基质的复杂生态系统。未来的方向是开发更复杂的多细胞共培养体系，例如将癌细胞、细菌与免疫细胞（如细胞毒性CD8+T淋巴细胞、树突状细胞 (Dendritic Cells, DCs)）进行三向共培养，以研究免疫应答在细菌疗法中的作用。已有研究利用Transwell模型，在顶部用幽门螺杆菌 (Helicobacter pylori) 感染胃黏膜类器官，底部培养DCs，成功观察到了细菌感染对DC活化的影响。
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标准化与可重复性：缺乏标准化的类器官和共培养方案，以及培养基质、培养基批次、细菌接种量感染复数 (Multiplicity of Infection, MOI) 等因素的差异，都会影响结果的可靠性和跨研究可比性。推动建立适用于细菌-哺乳动物细胞共培养的最佳实践、最低表征和报告标准，将有助于确保该领域研究的质量和可重复性。
结论
真核-原核细胞共培养模型是深入理解细菌与哺乳动物细胞间复杂相互作用的宝贵工具。根据具体的科学问题，可以选择不同复杂程度的模型来更好地模拟体内条件。由于没有任何一个体外或体内模型能完全复现患者TME的全部复杂性，因此，需要结合来自多种精心设计的模型的数据，形成临床前证据链。虽然动物模型在毒性、生物分布测试中仍不可或缺，但共培养平台能够在临床转化之前，为工程菌的机制研究和疗效评估提供关键的补充证据。未来，通过提高临床数据报告的透明度、建立标准化的临床前报告体系，并完善针对抗癌LBT的监管框架，将有力推动这一充满希望的疗法从实验室走向病床。
