《Cells》：Cell-Free DNA as Biomarker in Oral Squamous Cell Carcinoma: Dynamics, Mutational Landscape and Clinical Implications
Pedro Veiga,
Leonor Barroso,
Luís Miguel Pires,
Carolina Mano,
Francisco Caramelo,
Isabel Marques Carreira,
Ilda Patrícia Ribeiro and
Joana Barbosa de Melo
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为解决口腔鳞癌（OSCC）传统组织活检的有创性和时空局限性问题，研究人员开展了一项关于cfDNA在OSCC患者血浆和尿液样本中浓度动态与基因组特征的前瞻性研究。结果显示，cfDNA浓度在治疗后先短暂升高后回落，可动态反映治疗反应；其突变谱捕获了TP53、PIK3CA、KRAS、APC、FBXW7等关键基因的复发性突变，并揭示了肿瘤异质性。研究表明，尽管cfDNA定量本身预后价值有限，但结合靶向二代测序（NGS）的液体活检可作为OSCC无创分子监测和个体化管理的有效补充工具。
口腔鳞状细胞癌（Oral Squamous Cell Carcinoma, OSCC）是头颈部最常见的恶性肿瘤之一，尽管诊断和治疗有所进展，但晚期患者的预后仍然不佳。传统的肿瘤诊断和监测主要依赖组织活检，这种侵入性方法不仅给患者带来痛苦，还难以实时、动态地反映肿瘤的全貌和演进过程，尤其难以捕捉肿瘤的异质性和治疗过程中的分子变化。为了克服这些挑战，液体活检作为一种新兴技术备受关注，它通过分析血液、尿液等体液中的循环肿瘤成分，有望实现无创、实时的肿瘤监测。然而，在口腔鳞癌领域，针对循环游离DNA（cfDNA）在血浆和尿液中的动力学特征，以及其基因突变景观的系统性研究仍然相对匮乏。这项研究正是为了填补这一空白，评估cfDNA在OSCC患者中的动态变化及其与基因组特征、临床结局的关联，探索其作为实时、无创生物标志物的潜力。相关成果发表在国际期刊《Cells》上。
为开展这项研究，研究者主要应用了以下几个关键技术方法：首先，他们招募了一个前瞻性的口腔鳞癌患者队列（n=32），并从其中5名具有多时间点样本的患者中选取了详细的基因组特征分析队列。其次，他们从患者的血浆和尿液样本中分离并定量了cfDNA，以分析其浓度动态。最后，他们对肿瘤组织和系列血浆/尿液cfDNA样本进行了靶向二代测序（Next-Generation Sequencing, NGS），使用Oncomine Colon cfDNA panel分析了包括TP53、PIK3CA、KRAS、APC、FBXW7等在内的14个基因的热点突变，以绘制突变景观并追踪其演化。
研究结果
3.1. 循环游离DNA（cfDNA）动力学
3.1.1. 患者与对照组的cfDNA浓度
在治疗前，OSCC患者（n=32）的血浆cfDNA平均浓度略高于健康对照（n=5）。患者的血浆cfDNA平均浓度为0.372 ± 0.312 ng/μL，尿液平均浓度为0.382 ± 0.205 ng/μL。
3.1.2. 不同时间点的cfDNA浓度
总体而言，cfDNA水平在不同时间点保持相对稳定，但治疗开始后出现了一个明显的峰值。血浆cfDNA平均浓度从基线（TP1）的0.372 ± 0.312 ng/μL上升到治疗开始后（TP2）的1.106 ± 0.811 ng/μL，随后逐渐下降。而尿液cfDNA浓度随时间波动较小。
3.1.3. 按肿瘤分期划分的cfDNA浓度
当按肿瘤分期（I–III期 vs. IV期）分层时，早期患者（I–III期）的血浆和尿液cfDNA平均浓度均略高于晚期患者（IV期）。这表明在本队列中，cfDNA浓度与肿瘤分期无显著关联。
3.1.4. 存在转移或复发患者的cfDNA浓度
比较发生转移或复发的患者与未发生患者的cfDNA水平，并未发现平均cfDNA浓度存在实质性差异。
3.1.5. cfDNA浓度与患者生存期
通过Kaplan-Meier生存分析比较高、低cfDNA水平患者的无进展生存期（Progression-Free Survival, PFS），两组间的PFS概率曲线高度重叠，中位PFS无显著差异。这表明基线cfDNA浓度在本队列中不能作为预测PFS的可靠生物标志物。
3.1.6. 接受NGS分析的五名患者的治疗时间点cfDNA动力学
在五名接受NGS分析的患者（P1–P5）中，评估了治疗前后多个时间点的cfDNA浓度动态。所有五名患者在治疗开始后cfDNA浓度均较基线水平有所增加，其升高程度和持续时间在患者间存在差异。患者P1和P2在治疗后表现出中度增加随后逐渐下降；患者P3和P5表现出最显著的增加；而患者P4在整个随访期间维持了较低且稳定的水平。在患者P3、P4和P5中，临床确认的疾病事件（如转移、复发）发生前观察到了cfDNA谱的细微变化，提示纵向监测cfDNA可能有助于早期发现疾病进展。
3.2. 液体活检
3.2.1. 突变景观
通过对5名患者的肿瘤组织和多时间点血浆、尿液cfDNA进行靶向NGS分析，绘制了突变图谱。总体而言，其突变景观高度异质，包括单核苷酸变异（Single-Nucleotide Variants, SNVs）和复发性的热点突变。在治疗前样本（组织和血浆TP1）中共检测到76个突变，其中30.3%在组织和液体活检中均被检测到，47.4%为组织独有，22.4%为液体活检独有。最常突变的基因是TP53（24个突变），其次是KRAS、EGFR和APC。一些突变仅在组织中发现（如FBXW7、CTNNB1、GNAS），而MAP2K1突变仅在液体活检中观察到。
3.2.2. 患者P1–P5的动态突变景观
对患者P1–P5的系列样本进行详细分析，揭示了动态的克隆演化。例如，在患者P1中，血浆cfDNA分析显示TP53突变（p.P278A和p.Y220C）的频率随时间发生显著变化，并检测到仅在后期血浆中出现的SMAD4 p.A118V突变，提示了疾病进展中出现了亚克隆变异。在患者P3、P4、P5中，也观察到了复杂的突变谱，涉及TP53、APC、FBXW7、PIK3CA、KRAS等多个基因，并且尿液cfDNA也捕捉到了血浆或组织中未检测到的独特突变，支持了尿液液体活检的补充价值。
结论与讨论
本研究表明，对OSCC患者的血浆和尿液进行cfDNA分析，具有作为无创生物标志物的潜力。研究发现患者治疗前cfDNA浓度略高于健康对照，且大多数患者在治疗开始后血浆cfDNA出现短暂、显著的升高，随后逐渐恢复，这反映了治疗诱导的肿瘤细胞死亡，支持了cfDNA作为实时评估治疗反应动态标志物的价值。然而，研究也发现，基线cfDNA浓度与肿瘤分期、是否发生转移/复发以及无进展生存期（PFS）之间均无显著关联，这表明单纯的cfDNA定量可能不足以作为可靠的预后标志物。
在基因组层面，研究揭示了OSCC患者中存在TP53、PIK3CA、KRAS、APC、FBXW7等关键癌症相关基因的复发性热点突变，这与已知的口腔癌发生、发展通路相符。突变分析显示，约30.3%的突变在肿瘤组织和液体活检中共享，而近半数（47.4%）的突变仅存在于组织，22.4%的突变仅存在于液体活检。这突显了虽然组织活检对于初始诊断至关重要，但液体活检能够揭示因肿瘤异质性而可能被组织取样遗漏的亚克隆群体或转移灶的额外突变，具有补充价值。值得注意的是，尿液cfDNA也捕捉到了血浆或组织中不存在的一些突变，进一步证实了其作为补充样本来源的潜力。
该研究也指出了自身的局限性，包括样本量相对较小，以及样本处理、测序技术等因素可能影响cfDNA检测的敏感性和特异性。未来的研究需要更大规模的队列、标准化的方法学，并将cfDNA定量分析与基因组、临床数据更紧密地整合，以验证其预后价值并推进其向临床常规应用的转化。
总而言之，这项工作支持cfDNA分析作为一种动态、微创的工具，用于监测OSCC的疾病进展和治疗反应。尽管其定量单独应用的价值有限，但结合靶向NGS等基因组学分析，液体活检为更全面、实时地理解肿瘤分子特征、实现个性化管理提供了有前景的途径。
