《Molecules》：Enhanced In Vitro Stability of Bedaquiline with Ascorbic Acid and Pyruvate During Long-Term Incubation in Mycobacterium Species
Sara Batista,
Jordi Lamata,
Lidia Feliu,
Marta Planas,
Mariana Fernandez-Pittol,
Diego Martinez,
Lorena San Nicolás,
Griselda Tudó and
Julian Gonzalez-Martin
编辑推荐：
在分枝杆菌药物敏感性测试中，因检测周期长，抗生素的体外化学稳定性是影响结果准确性的关键因素。本文研究人员评估了包括比格达林(BDQ)在内的多种抗生素在37°C下预孵育后的稳定性。研究发现，在长期孵育条件下，BDQ的抗菌活性会下降，导致其最低抑菌浓度(MIC)显著升高。然而，当BDQ与抗坏血酸(AA)和丙酮酸(P)联合使用时，其MIC值的波动可被有效抑制，表明AA/P组合可作为BDQ在体外药敏测试中的一种有效稳定策略。这项工作为优化耐多药结核病的实验室检测方法提供了重要参考。
在对抗结核病，特别是耐多药结核病的漫长斗争中，新药的出现带来了希望，但如何准确评估这些药物的效果，却是一个容易被忽略的实验室“盲点”。想象一下，为了测定一种药物能否有效杀死生长缓慢的分枝杆菌，我们通常需要将药物与细菌在培养体系中共同孵育数天甚至数周。但问题随之而来：在这段漫长的等待时间里，药物本身会不会“未战先衰”，在发挥作用前就悄悄降解了呢？如果药物不稳定，那么测出的“药效”就会大打折扣，从而误导医生对药物真实效力的判断，甚至影响临床治疗方案的选择。这正是研究人员开展此项研究的核心出发点。
为了探究这个潜在的隐患，Sara Batista等研究人员在《Molecules》杂志上发表了一项研究，系统评估了包括比格达林(Bedaquiline, BDQ)、普托马尼(Pretomanid, PTM)、德拉马尼(Delamanid, DLM)、氯法齐明(Clofazimine, CFZ)等新型抗结核药物，以及利奈唑胺(Linezolid, LZD)、莫西沙星(Moxifloxacin, MOX)等治疗耐多药菌感染的药物，在模拟药敏测试条件下的体外稳定性。他们尤其关注了BDQ——一种对耐多药结核病至关重要的新药——在37°C长期孵育后，其最低抑菌浓度(Minimum Inhibitory Concentration, MIC)是否会发生漂移。
研究人员设计了一个严谨的实验流程：他们首先制备了各种抗生素的工作液，一部分立即冻存（0天组），另一部分在37°C下预孵育7天（7天组），之后再进行MIC测定。如果在预孵育后，某种抗生素的MIC值出现了两个或更多倍比稀释度的升高，则认为其稳定性不足。随后，他们会将这种不稳定的抗生素与两种潜在的稳定剂——抗坏血酸(Ascorbic Acid, AA)和丙酮酸(Pyruvate, P)——组合，再次进行同样的稳定性测试，观察稳定剂是否能防止MIC的升高。
本研究所采用的关键技术方法主要包括：微量肉汤稀释法，用于精确测定各种抗生素对临床分离的分枝杆菌菌株（包括4株结核分枝杆菌和8株鸟-胞内分枝杆菌复合群菌株）的最低抑菌浓度；以及电喷雾电离质谱分析，用于从化学结构层面分析比格达林在不同孵育条件下的降解产物。研究样本为来自巴塞罗那医院诊所微生物科的临床分离株。
研究结果
1. 大多数测试抗生素在孵育期间保持稳定
在测试的所有抗生素中，氯法齐明、利奈唑胺、莫西沙星、普托马尼、异烟肼、克拉霉素、德拉马尼、乙胺丁醇和利福平均表现出良好的稳定性。无论是针对结核分枝杆菌还是鸟-胞内分枝杆菌复合群临床分离株，这些药物在预孵育7天后的MIC值与未孵育的样品相比，要么保持不变，要么仅有一个稀释度的变化，这属于实验允许的正常波动范围。
2. 比格达林在37°C孵育后活性显著降低
与上述药物形成鲜明对比的是，比格达林在37°C下预孵育7天后，其对所有测试菌株的MIC值均出现了两个或更多稀释度的显著升高。例如，对于结核分枝杆菌，MIC范围从0.01-0.06 μg/mL升高到了0.06-0.25 μg/mL；对于鸟-胞内分枝杆菌复合群，则从0.03-0.125 μg/mL升高至0.125-0.5 μg/mL。这一结果表明，在标准的体外药敏测试条件下，BDQ的抗菌活性会因时间推移而明显下降。
3. 抗坏血酸与丙酮酸可抑制比格达林MIC的升高
关键的发现出现在稳定性测试阶段。当比格达林与抗坏血酸和丙酮酸联合使用时，即使经过7天的预孵育，其MIC值也能维持在接近新鲜配制样品的水平。具体而言，在结核分枝杆菌中，与未加稳定剂的预孵育BDQ相比，添加AA/P的BDQ其MIC降低了三到四个稀释度；在鸟-胞内分枝杆菌复合群中，也降低了两到三个稀释度。这说明AA/P的组合有效地防止了BDQ在孵育过程中抗菌活性的丧失。
4. 质谱分析揭示了比格达林的化学变化
为了从化学角度探究原因，研究人员采用了电喷雾电离质谱进行分析。结果显示，新鲜配制的BDQ溶液仅在质荷比(m/z) 557处有一个主峰，对应完整的BDQ分子。然而，在37°C下孵育7天的BDQ溶液中，除了m/z 557的峰，还出现了m/z 523和539两个新峰。即使在添加了AA/P的情况下孵育，这两个新峰依然会出现。当BDQ与细菌共同孵育时，m/z 557的峰甚至完全消失，仅能检测到m/z 523和539的峰。这些新峰可能对应BDQ的氧化降解产物，表明BDQ在实验条件下发生了化学结构改变。
研究结论与讨论
本研究的主要结论是，在模拟体外药敏测试的含水环境中长期孵育，比格达林会发生化学降解，导致其抗菌活性降低，表现为最低抑菌浓度升高。这一现象是BDQ特有的，其他测试的抗生素在相同条件下均保持稳定。尽管电喷雾电离质谱数据显示抗坏血酸和丙酮酸未能阻止BDQ降解产物的生成，但从微生物学活性角度看，这两种物质的组合能够有效维持BDQ的抗菌效力，使其MIC值在长期孵育后不发生显著漂移。
这一发现具有重要的实际意义。它提示实验室在进行需要长期孵育的分枝杆菌药敏试验（如时间-杀菌曲线测定）时，BDQ的降解可能是一个影响结果准确性的潜在因素。在BDQ工作液中加入抗坏血酸和丙酮酸，可以作为一种简单有效的稳定策略，从而提高MIC测定的可靠性。这对于准确评估结核分枝杆菌及非结核分枝杆菌对BDQ的敏感性、指导临床用药至关重要。
然而，论文的讨论部分也谨慎地指出，AA/P表现出的“稳定”作用，其机制可能并非简单的化学保护。质谱数据并未显示AA/P能阻止BDQ降解产物的形成。相反，AA/P可能通过其他途径，例如影响细菌的生理状态（如诱导休眠样状态、增加氧化还原压力等），间接增强了细菌对BDQ的敏感性，从而在表观上“补偿”了因药物降解造成的活性损失。尤其是在结核分枝杆菌中观察到的效应比在鸟-胞内分枝杆菌复合群中更明显，这暗示了物种特异性的生理反应可能参与其中。此外，研究强调，这种不稳定性是针对纯化合物在特定体外实验条件下的观察，并不等同于BDQ成品药在临床使用中存在稳定性问题，因为药品配方中的辅料能有效保持药物的完整性。
综上所述，这项研究揭示了一个在分枝杆菌药物敏感性测试中此前被忽视的技术细节，并为优化以比格达林为核心的体外药敏方案提供了实验依据。尽管其保护机制仍有待进一步阐明，但使用抗坏血酸和丙酮酸作为稳定剂，无疑为提升耐多药结核病实验室诊断的准确性提供了一种实用且高效的方法。
