基于转录组学指导的大肠杆菌代谢工程高效合成1,5-戊二醇

《Microorganisms》：Enhancing Synthesis Efficiency in Microbial 1,5-Pentanediol Production Through Transcriptomics-Informed Metabolic Engineering of Escherichia coli Hongyu Deng, Fei Meng, Yihao Sun, Yang Song, Chunhui Zhao, Xiaonan Wang, Yan Zhang, Ruiming Wang and Ning Chen

微生物发酵生产重要平台化学品1,5-戊二醇（1,5-PDO）面临产量低、代谢瓶颈不明等挑战。为解决这些问题，研究人员采用比较转录组学方法，系统性筛选并验证了能够提升1,5-PDO合成的非直观靶点基因。通过过表达铁(III)-柠檬酸转运蛋白编码基因fecA和敲除谷氨酸脱羧酶编码基因gadA，优化菌株在5 L发酵罐中实现了12.45 g/L的1,5-PDO产量和0.26 mol/mol的葡萄糖转化率，显著提高了合成效率。该研究为基于系统代谢工程优化微生物细胞工厂提供了新策略。

　　

1,5-戊二醇（1,5-PDO）是一种多用途的平台化学品，在化妆品、塑料、制药和聚酯合成等领域有广泛应用。随着全球对可持续能源和绿色化学品需求的增长，利用微生物发酵生产高附加值化学品成为研究热点。然而，目前微生物生产1,5-PDO的产量普遍较低，对潜在的代谢瓶颈也缺乏全面理解。传统的代谢工程多聚焦于对已知途径酶的理性设计，往往忽略了宿主细胞中非直观的调控节点和辅助代谢基因。为了突破这一瓶颈，亟需从系统水平探究并优化1,5-PDO的合成网络。本项发表于《Microorganisms》的研究，正是通过整合转录组学与逆向工程，为寻找提升1,5-PDO生产效率的隐藏“钥匙”提供了新思路。

研究者采用的关键技术方法包括：比较转录组学分析，在5 L生物反应器中，对产1,5-PDO工程菌株及其对照菌株W3110在指数期和稳定期取样，通过RNA-seq技术鉴定差异表达基因；基因功能验证，利用基于质粒的基因过表达和CRISPR干扰（CRISPRi）技术，对筛选出的20个候选代谢基因进行功能验证；基因组编辑，采用CRISPR/Cas9系统对关键靶点基因进行染色体整合（如将fecA整合到ilvG位点）或敲除操作；发酵性能评估，在摇瓶和5 L生物反应器规模进行分批补料发酵，通过HPLC（高效液相色谱法）量化1,5-PDO产量和OD₆₀₀监测细胞生长。

3.1. 发酵性能评估

研究发现，工程菌在摇瓶中可产生1.5 g/L的1,5-PDO，而在5 L生物反应器中进行分批补料发酵时，产量提升至12.1 g/L。与对照菌株相比，工程菌的生长受到一定抑制，说明1,5-PDO的合成给细胞带来了代谢负担。不过，生物反应器培养显著增强了细胞生长和产物合成能力。

3.2. 全局转录组学分析

通过对数期和稳定期的转录组比较分析，共鉴定出1384个在产1,5-PDO菌株中显著差异表达的基因，其中851个上调，533个下调。GO富集分析显示，转座相关功能被显著富集。进一步分析发现，产1,5-PDO菌株通过上调包括铁转运、应激响应等基因，以及下调与酸耐受、碳分解代谢物阻遏等相关的基因网络，重塑了其代谢状态以适应产物合成的压力。

3.3. 有益靶点基因的鉴定

研究者对20个候选基因进行了逆向工程验证。结果显示，过表达mqsR、mqsA、glf和fecA能显著提高1,5-PDO产量，其中过表达fecA的菌株P8产量最高，达到0.45 g/L，比对照提高22.2%。同时，利用CRISPRi技术抑制gadA和arrS的表达也能增强1,5-PDO合成，其中抑制gadA的菌株P13产量提升了15.2%。

3.4. 有益靶点在染色体上的评估

为了避免质粒带来的代谢负担，研究者将有益基因整合到染色体上。在摇瓶发酵中，单独整合fecA的菌株S4产量最高，为1.67 g/L。单独敲除gadA的菌株S5产量提升了9.3%，葡萄糖转化率提升了41.6%。最终，组合优化得到的菌株S7（整合fecA并敲除gadA）表现最优，其1,5-PDO产量达到1.7 g/L，葡萄糖转化率达到0.18 mol/mol，比出发菌株分别提升了13.3%和50%。

3.5. 5 L发酵罐的分批补料发酵

在5 L生物反应器的放大验证中，优化菌株S7实现了12.45 g/L的1,5-PDO产量，葡萄糖转化率达到0.26 mol/mol，比出发菌株（0.225 mol/mol）提高了15.6%。同时，菌株S7的最大OD₆₀₀达到23.4，生物量也提升了7.6%。这表明工程改造在提高产量的同时，也改善了细胞的整体适应性。

结论与讨论

本研究建立了一个强有力的、由转录组学指导的逆向工程框架，用于识别可增强大肠杆菌1,5-PDO合成的非直观代谢靶点。通过比较转录组学，研究者从1384个差异表达基因中筛选出关键基因。逆向工程验证表明，过表达铁(III)-柠檬酸转运蛋白基因fecA和敲除谷氨酸脱羧酶基因gadA能协同提升1,5-PDO合成。由此构建的优化菌株S7在摇瓶和5 L发酵罐规模均展现出显著提升的产量和碳转化效率。该工作不仅加深了我们对微生物如何适应产物合成压力的理解，也展示了一种通过系统水平分析来指导理性菌株改造、开发具有经济竞争力的1,5-PDO生物制造工艺的有效策略。尽管fecA和gadA改造带来的表型效益已得到实验证实，其具体的作用机制，例如fecA是否通过改善铁摄取或体内铁稳态来发挥作用，以及gadA敲除如何通过影响谷氨酸/GABA（γ-氨基丁酸）代谢、重新分配细胞资源或降低pH稳态的能量消耗来促进合成，仍有待未来通过靶向代谢物分析或同位素示踪代谢流分析等研究来阐明。此外，研究中尚未验证的1364个差异表达基因，特别是与NAD(P)H代谢、膜转运蛋白和酸耐受系统相关的基因，为未来通过整合转录组数据与基因组规模代谢模型，进行下一代计算-代谢工程以持续提升生产指标，提供了宝贵的资源库。