《SCIENCE ADVANCES》：Transcriptional readthrough precedes alternative splicing programs triggered in CML cells by imatinib
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针对伊马替尼（imatinib）治疗慢性髓系白血病（CML）早期响应机制不清的问题，本研究利用新生RNA长读长测序揭示：伊马替尼在1小时内即可诱导转录通读（transcriptional readthrough），表现为RNA聚合酶II（Pol II）越过基因多聚腺苷酸化切割位点（PAS），且该现象早于基因表达与可变剪接改变。研究发现通读产生“通读嵌合体”（readthrough chimeras），其上游基因外显子与下游基因外显子异常拼接，且在伊马替尼耐药K562细胞及CML患者细胞中均检测到此类异构体。该研究首次将转录通读确立为伊马替尼响应的早期标志，为理解治疗耐药与细胞分化提供了新的分子视角。
在癌症治疗的战场上，靶向药物就像精确制导的导弹，本应直击癌细胞要害。然而现实中，肿瘤细胞总能找到“逃生通道”——耐药。慢性髓系白血病（CML）的经典靶向药伊马替尼（imatinib）便是如此：它能高效抑制致癌蛋白Bcr-Abl1激酶，却仍有部分患者因长期用药产生耐药，甚至在治疗早期就悄然启动细胞命运转变。更令人困惑的是，传统研究多关注数天至数月的基因表达变化，却鲜有人追问：在药物接触后的第一个小时内，癌细胞究竟发生了什么？是否存在被忽视的早期分子事件，悄悄为后续的耐药与分化埋下伏笔？
这正是本研究试图破解的核心谜题。来自耶鲁大学等机构的研究团队敏锐捕捉到“转录通读”这一曾被低估的现象——当RNA聚合酶II（Pol II）在转录时未能正常切割RNA的3'端（多聚腺苷酸化切割位点，PAS），而是持续延伸越过基因边界进入下游区域，这种现象被称为转录通读。此前研究发现，缺氧、热休克等应激会触发通读，但在靶向药物治疗下的早期响应机制仍是空白。更重要的是，通读是否会像“多米诺骨牌”的第一张，引发后续可变剪接、嵌合RNA产生，甚至影响细胞分化与耐药？这些问题关乎对CML治疗响应的深层理解。为此，研究团队以CML细胞系K562为模型，结合长读长测序等前沿技术，展开了一场“时间分辨率极高”的分子追踪，相关成果最终发表于《SCIENCE ADVANCES》。
研究的关键技术方法包括：采用新生RNA长读长测序（PacBio平台）量化转录通读，定义读通指数（RTI）评估基因特异性通读水平；通过短读长RNA-seq（Illumina NovaSeq）分析可变剪接（使用rMATS-turbo工具）与基因表达（DESeq2）；利用SOAPfuse检测相邻基因的通读嵌合体；结合RT-qPCR、Western blot验证关键基因（如UROD、HBE1）的表达与剪接变化；样本涵盖K562细胞（对照组、1小时/18小时伊马替尼处理组、JTE-607抑制剂组）、伊马替尼耐药K562细胞（10个月诱导）及CML患者CD34+细胞（诊断 vs 6个月治疗后）。
伊马替尼在K562细胞中诱导转录通读
通过新生RNA长读长测序发现，伊马替尼处理1小时后，K562细胞中转录通读显著增加——表现为越过PAS的长读长RNA比例升高，且这一现象早于基因表达变化。研究定义“读通指数（RTI）”为长读长中未有效切割的RNA占比，结果显示伊马替尼1小时组（IM 1h）的RTI显著高于对照组（CTRL），且与直接抑制切割和多聚腺苷酸化复合物（CPC）的JTE-607相比，伊马替尼诱导的通读基因集具有独特性（仅528个基因与对照组重叠）。热图分析进一步证实，IM 1h与18小时组（IM 18h）的通读基因表达模式相似，提示早期通读是伊马替尼响应的快速事件。
所有条件下通读均与内含子滞留相关
长读长数据揭示，通读转录本（3'端位于PAS下游≥100 nt）的内含子滞留（intron retention，RI）率（~75%）显著高于基因体内转录本（~35%），且该关联不受伊马替尼影响。以尿卟啉原脱羧酶基因（UROD）为例，其通读转录本多为未剪接状态，且IM处理后RTI进一步升高。值得注意的是，约44个基因表现出“全或无”加工模式（RTI≥0.2且共转录剪接效率CoSE≤0.7），其中UROD等基因的富集分析指向红细胞生成相关功能，暗示通读可能与细胞命运转变相关。
伊马替尼诱导的通读伴随红细胞分化
短读长polyA+RNA-seq显示，IM 18小时组中1818个高RTI基因里，78%在6-18小时内表达下调，而低RTI基因则多上调。这些高RTI基因与红细胞分化相关——如血红蛋白ε（HBE1）、铁蛋白重链（FTH1）的表达随通读增加而升高，且RT-qPCR验证伊马替尼（而非他拉唑帕尼BMN或高三尖杉酯碱HHT）可特异性诱导其通读。Western blot检测到红细胞分化标志物γ/ε珠蛋白、Kell内切肽酶（KEL）上调，流式细胞术进一步证实48小时伊马替尼处理后，K562细胞分化为CD45+CD235a+红母细胞，提示通读可能是红细胞分化的早期驱动事件。
伊马替尼导致伴或不伴通读的可变mRNA异构体
核RNA短读长测序（rMATS分析）发现，IM 18小时组出现~500个可变剪接事件（主要是外显子跳跃CE），远超1小时组（仅20个）和JTE处理组（~40个）。其中，翻译起始因子EIF4H的外显子5（CE）在伊马替尼和JTE处理后均被排除，导致长异构体减少、短异构体增加——该异构体可能通过改变与eIF4A解旋酶的相互作用影响翻译。此外，伊马替尼耐药K562细胞（10个月）与患者CD34+细胞（6个月治疗）中，均检测到与红细胞分化相关的可变剪接事件（如NFE2L1/NRF1的异构体切换、EIF4A2的“毒外显子”排除），提示早期剪接变化可能是耐药的前兆。
伊马替尼调节嵌合mRNA的形成
通过SOAPfuse分析发现，伊马替尼耐药K562细胞与CML患者CD34+细胞中嵌合RNA数量最多，其中RBM14-RBM4嵌合体（上游RBM14 exon1与下游RBM4 exon2拼接）在IM 18小时组显著升高。RT-qPCR验证显示，健康供体与CML患者的CD34+细胞中，RBM14-RBM4和ZNF649-ZNF577嵌合mRNA表达量在CML患者中显著增加；K562细胞中，ARPC4-TTL3、CECR7-IL17RA等嵌合体在18小时伊马替尼处理后表达上调。这些嵌合体的形成依赖两个条件：上游基因剪接抑制与下游基因转录通读，且其表达水平与伊马替尼处理时间正相关。
研究结论与讨论部分强调，伊马替尼诱导的分子级联反应始于1小时内的转录通读，随后依次触发内含子滞留、可变剪接（18小时）及嵌合RNA形成，最终推动红细胞分化与潜在耐药。这一“时间轴”突破了传统认知——此前认为红细胞分化需数天，而本研究证明伊马替尼可在1小时内启动相关基因程序；同时，通读嵌合体（如RBM14-RBM4）不仅是CML的标志物，其编码的融合蛋白还可能成为免疫治疗新靶点（如neoepitopes）。此外，研究揭示了伊马替尼作用的特异性：不同于直接抑制CPC的JTE-607，其通读诱导依赖于Bcr-Abl1激酶抑制引发的应激，且与SR蛋白激酶1（SRPK1）、Gemin5等剪接因子下调相关。这些发现为理解靶向治疗的早期响应机制提供了全新视角，也为开发基于转录通读或嵌合RNA的耐药监测策略奠定了基础。
