CARMIL1二聚化与自抑制机制的结构解析及其通过天线基序调控肌动蛋白帽化蛋白活性的分子基础

《SCIENCE ADVANCES》：Mechanisms of CARMIL dimerization, autoinhibition, and capping protein binding

本研究针对肌动蛋白帽化蛋白（CP）活性调控机制不清及CARMIL1自抑制构象难题，通过冷冻电镜解析ΔC-CP复合物3.4 ?结构，首次发现介导二聚化与自抑制的"天线"基序（T916-A935）。结合生化与单细胞TIRF显微术证实，破坏天线-LRR互作可部分解除自抑制，显著提升CP解帽活性。细胞实验揭示天线突变体增大铺展面积，而缺失PR结构域诱导膜棘突形成。该研究阐明CARMIL协调CP与肌球蛋白-I（myosin-I）活性的三维机制，为细胞运动与黏着斑调控提供新视角。

　　

在细胞的微观世界里，肌动蛋白（actin）构成的动态网络如同建筑的钢筋骨架，支撑着细胞形态变化与运动迁移。其中，位于肌动蛋白丝（filament）正端的"帽化蛋白"（Capping Protein, CP）扮演着至关重要的"刹车片"角色——它能以亚纳摩尔级亲和力封锁正端单体交换，有效终止聚合。然而，细胞迁移需要精密调控这个"刹车"，此时就需要CARMIL（CP, Arp2/3 complex, myosin-I linker）家族蛋白登场。尽管已知CARMIL通过其CP结合区（CBR）调控CP，但包含PH、LRR、HD、CBR和PR等多个结构域的完整分子如何协同工作？特别是CARMIL自身是否存在自抑制状态？其独特的二聚化特征如何影响功能？这些谜题长期困扰着学界。

为此，来自宾夕法尼亚大学等机构的研究团队在《SCIENCE ADVANCES》发表突破性研究，综合运用冷冻电子显微镜（cryo-EM）、微流控-全内反射荧光显微术（microfluidics-TIRF）及细胞生物学手段，首次揭示了人源CARMIL1通过新型"天线"基序实现二聚化与自抑制的分子机制，并阐明其与肌球蛋白-I（myosin-I）协同调控细胞形态的生物学意义。

研究关键技术方法包括：利用冷冻电镜解析ΔC-CP复合物3.4 ?分辨率结构；基于GraFix梯度固定与质量光度法验证复合物化学计量比；采用微流控-TIRF单丝水平实时观测解帽动力学；构建CARMIL1敲除（KO）HT1080细胞系进行功能挽救实验；通过CRISPR-Cas9基因编辑与免疫荧光定量分析细胞形态学变化。

CARMIL1 is partially autoinhibited

通过焦磷酸盐-肌动蛋白聚合 assay 发现，人源CARMIL1_1-1046（ΔC）的抑制CP封端效率显著低于其分离的CBR（961-1046），表明全长分子存在部分自抑制。质谱分析进一步揭示CSI基序（E1014-K1036）内T1035/S1039磷酸化可能参与活性调控，磷酸模拟突变体ΔC_DD显著降低解帽能力。

Structure of the ΔC-CP complex and mechanisms of dimerization, autoinhibition, and CP binding

3.4 ?冷冻电镜结构显示ΔC形成反平行二聚体，PH-LRR平面两侧分布HD与CP结合模块。关键发现是位于HD与CBR连接处的"天线"基序（T916-A935）插入LRR-LRR界面。该基序在120个物种中高度保守，其电荷反转突变体ΔC_EE（R927E/R930E）通过破坏与LRR的互作，在结构上解释了自抑制释放的分子基础。

Disrupting the antenna-LRR interaction through mutagenesis partially relieves autoinhibition

生化实验证实ΔC_EE的解帽活性介于ΔC与CBR之间。单细胞TIRF成像直观显示，ΔC_EE处理的肌动蛋白丝解帽速率显著高于野生型ΔC，但弱于纯CBR，证明天线基序通过限制CBR-CP空间位阻贡献自抑制。该现象在ensemble与single-molecule水平均得到验证。

CARMIL1 contributes to focal adhesion, stress fiber, and cell protrusion organization

在CARMIL1 KO HT1080细胞中，表达全长天线突变体FL_EE使细胞铺展面积从1336±327 μm²增至2092±819 μm²（P<0.0001）。而缺失PR结构域的ΔC则诱导大量非典型膜棘突形成，且无法挽救KO细胞增大的黏着斑表型，提示PR结构域通过结合肌球蛋白-I SH3结构域调控细胞骨架重塑。

本研究首次阐明CARMIL1通过天线基序实现二聚化与自抑制的双重调控机制：结构上，天线基序像"定位销"锁定CBR-CP模块相对于LRR-HD核心的空间取向；功能上，破坏该互作可增强CP解帽活性，促进细胞皮层肌动蛋白聚合与膜突起。特别值得注意的是，PR结构域通过募集肌球蛋白-I协调黏着斑成熟，这一发现将CP调控与机械力感知通路相关联。与单纯CBR相比，全长CARMIL1的自抑制状态可能代表生理相关的活性调定点，其CSI基序磷酸化（如T1035/S1039）提供了翻译后修饰层面的精细调节维度。这些发现不仅完善了CPI基序蛋白家族的作用范式，更为理解细胞迁移、胞吞等依赖肌动蛋白动力学的病理过程（如肿瘤转移）提供了新的分子靶标。