《Acta Biomaterialia》：In vivo self-assembled DNA vaccine elicits efficient immune protection against viral myocarditis by targeting draining lymph nodes
编辑推荐：
本研究构建了ABD与Protamine N/C末端融合蛋白AP/PA，自组装形成170-200 nm纳米疫苗。AP组淋巴结富集度（1.8倍）、中和抗体水平及CD8+ T细胞激活（4.45%）显著优于PA/Protamine组，并有效降低CVB3心肌炎的心肌病毒载量及病理损伤，证实ABD介导的淋巴结靶向策略可显著提升DNA疫苗疗效。
王彤|林凯|葛一辉|熊思东|岳燕
中国苏州苏州大学生物与医学科学研究院感染与免疫江苏省重点实验室
摘要
在本研究中，我们通过将链球菌白蛋白结合域（ABD）连接到精蛋白（P）的N端（AP）或C端（PA），制备了两种重组融合蛋白。这些蛋白能够与CVB3 VP1 DNA疫苗（pVP1）自发组装成纳米疫苗，利用ABD的白蛋白结合能力靶向引流淋巴结（dLNs），从而增强免疫原性和疗效。所有重组的AP、PA和P蛋白均能有效结合并保护pVP1质粒，形成直径为170-200纳米的纳米颗粒。体内分布实验表明，AP-pVP1的富集程度比PA-pVP1和P-pVP1高约1.8倍。肌肉注射后，AP-pVP1组表现出最高的CVB3特异性中和血清IgG水平。其细胞毒性反应分别比PA-pVP1组和P-pVP1组高约31%和90%。AP-pVP1组中IFN-γ+CD8+ T细胞的百分比为4.45%，显著高于PA-pVP1组的3.51%和P-pVP1组的2.84%。在病毒攻击下，AP-pVP1组表现出更好的保护效果，包括最低的心脏病毒载量、最小的心肌组织学变化以及最高的存活率。我们的研究表明，ABD介导的白蛋白劫持通过靶向dLNs的能力增强了CVB3 DNA疫苗的疗效。我们还发现，融合蛋白中ABD的位置会影响淋巴结的靶向效果。这些发现可能为开发有效的CVB3疫苗提供启示。
意义声明
为了提高基于精蛋白的DNA疫苗载体对淋巴结的靶向递送效果，我们通过将链球菌白蛋白结合域（ABD）与精蛋白融合，设计了重组蛋白。这种方法利用了ABD结合白蛋白的能力，而白蛋白会自然运输到淋巴结，从而主动引导DNA-精蛋白纳米疫苗到达引流淋巴结。ABD的融合位置显著影响了靶向效率：N端融合（AP）比C端融合（PA）或未经修饰的精蛋白更能增加淋巴结的积累。含有AP和编码CVB3 VP1的质粒的DNA疫苗诱导了强烈的中和抗体反应和CD8? T细胞活性，从而提高了对CVB3心肌炎的保护效果。这种白蛋白介导的靶向策略为通过主动淋巴递送增强DNA疫苗的疗效提供了可行的平台。
引言
肠道病毒，特别是柯萨奇病毒B3（CVB3），是病毒性心肌炎的重要病因；然而，目前尚无获批的CVB3疫苗。已经研究了多种疫苗平台，包括灭活疫苗、减毒活疫苗、亚单位疫苗、核酸疫苗、类病毒颗粒疫苗和病毒载体疫苗[[1], [2], [3], [4]]。其中，DNA疫苗特别有吸引力，因为它们可以模拟自然感染并诱导强烈的抗原特异性T细胞反应。然而，其临床应用很大程度上依赖于高效且生物安全的递送系统。
精蛋白（P）是一种富含精氨酸的阳离子蛋白，来源于鲑鱼精子。它通过静电相互作用与DNA形成稳定的纳米复合物（100-200纳米）[5,6]。然而，其转染效率有限。加入脂质或脂质体可以提高转染效率[7,8]，但相关的细胞毒性和免疫原性会阻碍临床应用。由于引流淋巴结（dLNs）是启动适应性免疫反应的关键部位，因此将其靶向递送到dLNs对于疫苗疗效至关重要。
白蛋白是淋巴液中含量最丰富的内源性蛋白质，可通过淋巴系统高效运输。通过与多种内源性和外源性生物及化学配体的结合，白蛋白显著延长了它们的循环半衰期[9]。这些药代动力学特性使得白蛋白结合疫苗能够靶向递送到dLNs[10,11]，从而增强抗原呈递，促进CD8?和CD4? T细胞的激活，并减少脱靶系统的暴露和毒性[12,13]。
白蛋白结合域（ABD）是一种由链球菌G蛋白衍生的46个氨基酸肽，能与人类、小鼠和大鼠的血清白蛋白高亲和力结合。将ABD融合到治疗性蛋白中，在药代动力学和生物分布方面具有多种优势，包括延长系统循环时间、增强被动淋巴和肿瘤靶向性以及提高生物利用度[10]。与PAS和XTEN多肽等其他延长半衰期的技术相比，ABD融合在肿瘤积累和细胞摄取方面表现出更好的效果[14]。在肿瘤学领域，ABD-Ec1融合增强了EpCAM阳性恶性肿瘤的选择性靶向，同时减少了肾脏积累[15]。在炎症性肠病（包括肥胖相关并发症、免疫性血小板减少症（ITP）和非酒精性脂肪肝病（NAFLD）中，ABD融合改善了功能活性和血浆半衰期，从而显著增强了治疗效果[[17], [18], [19]]。然而，当前的ABD融合蛋白疗法和疫苗面临两个关键转化挑战：首先，由于共价融合结构，制造过程复杂且成本高昂；其次，它们对不同抗原的适应性有限，需要针对每种新抗原重新设计序列并优化工艺[20,21]。此外，在非共价配方策略中，ABD与生物制剂的结合具有可逆性，这可能导致体内解离，影响靶向效果和整体递送效率。
基于ABD融合的精蛋白DNA递送系统是一种合理且有效的策略，可以解决这些限制。在本研究中，我们通过将ABD基因连接到精蛋白的N端（AP）或C端（PA），制备了靶向dLNs的DNA疫苗。这种位点特异性的共价融合结构消除了非共价ABD和载体配方中固有的体内解离风险，确保了白蛋白的持续结合和可靠的dLNs积累。ABD-精蛋白支架具有广泛的核酸兼容性，能够高效递送多种质粒DNA、mRNA和寡核苷酸治疗剂。这种通用性使ABD-精蛋白支架区别于传统的ABD融合蛋白疗法或抗原-载体结合物。
具体来说，我们分别将AP和PA与编码免疫优势CVB3衣壳蛋白VP1（pVP1）的质粒结合，生成了AP-pVP1和PA-pVP1疫苗配方。我们全面表征了它们的理化性质、在dLNs中的生物分布、对CVB3的体液和细胞免疫反应以及体内对病毒性心肌炎的保护效果。这些结果为合理设计广泛适用的dLNs靶向核酸疫苗提供了框架。
章节片段
质粒和重组蛋白的制备
编码重组蛋白AP、PA和P的cDNA由中国清科生物技术有限公司合成，随后克隆到带有His标签的原核表达载体PET32a中。通过限制性酶切和DNA测序验证后，将重组质粒分别转化到E. coli BL21(DE3)感受态细胞中。在室温下加入1mM IPTG诱导蛋白质表达6小时后，使用...自组装ABD-融合精蛋白-DNA纳米疫苗的制备和物理特性
在N端（AP）或C端（PA）与ABD肽融合的重组精蛋白（P）在E. coli中表达，并通过Ni柱层析纯化，蛋白质身份通过Western blot验证（图1B）。定量ELISA显示AP与MSA的结合能力更强（图1C），可能是因为AP中的N端ABD融合构象更有利于与MSA相互作用。圆二色性（CD）光谱确认了...讨论
靶向dLNs是增强疫苗诱导的T细胞免疫反应的重要策略。可溶性疫苗分子在穿过内皮屏障后容易进入淋巴毛细血管或血液，但在注射部位和引流淋巴结中的快速稀释和清除限制了免疫识别；相比之下，基于纳米颗粒的疫苗（20-200纳米）可以通过自由扩散、细胞运输或白蛋白搭便车有效到达淋巴系统，并在dLNs中持续存在...
资助
本工作得到了中国国家自然科学基金（82572092, 81970318, 3177096）、江苏省创新研究团队以及江苏省高等教育机构重点学术计划（PAPD）的资助。
CRediT作者贡献声明
王彤：撰写——原始草稿、研究、数据分析。林凯：可视化、验证。葛一辉：可视化、验证。熊思东：撰写——审稿与编辑、监督。岳燕：撰写——审稿与编辑、监督、资金获取。
