靶向ACE2受体与纳米抗体的融合设计：实现SARS冠状病毒广谱中和与心血管保护的新策略

《Antimicrobial Agents and Chemotherapy》：Multifunctional ACE2-nanobody fusion design for pan-specific neutralization and cardiovascular protection in SARS coronavirus infection

本研究针对新冠病毒感染中ACE2受体被病毒劫持并功能下调导致高血压与多器官损伤的临床难题，开发了一种名为VHHSpike-ACE2ECD-VHHAlbumin的三模块融合蛋白。研究人员将能广谱结合病毒刺突蛋白的纳米抗体、具有酶活性的ACE2胞外域以及可延长半衰期的白蛋白结合纳米抗体巧妙融合，在动物模型中实现了对多种病毒变异株的强效中和，并显著降低了高血压模型动物的收缩压，为治疗新冠病毒感染及其心血管并发症提供了兼具抗病毒与器官保护功能的新型候选疗法。

　　

新冠病毒引发的全球大流行，至今仍未完全平息。狡猾的SARS-CoV-2病毒入侵人体细胞的关键“钥匙”，是一种名为ACE2的受体蛋白。当病毒的“钥匙”刺突蛋白（Spike protein）与人体细胞的“锁”ACE2成功对接，大门即被开启，感染随之发生。然而，新冠病毒的入侵不仅是一场“破门而入”的劫掠，更是一场“拆锁”的破坏——病毒感染会下调ACE2的功能，导致一种名为血管紧张素II（Angiotensin-II, Ang-II）的物质在体内累积，而原本被ACE2分解产生的保护性物质血管紧张素1-7（Ang-(1-7)）则随之减少。这种失衡会引发高血压、急性呼吸窘迫综合征和急性肾损伤等多种严重并发症，成为许多重症患者面临的严峻挑战。

针对这一双重困境，科学家们很早就提出了“双管齐下”的治疗思路：设计一种既能抓住病毒、防止其感染细胞，又能提供外源性ACE2酶活性、恢复血压平衡的药物。早期的思路是直接使用可溶性的ACE2蛋白，但它在实际应用中存在两大短板：一是对病毒刺突蛋白的结合力不够强，二是进入血液后“寿命”太短，很快就被清除。为了克服这些障碍，发表在《Antimicrobial Agents and Chemotherapy》上的这项研究，提出并验证了一种创新的分子设计——“ACE2-纳米抗体”融合蛋白，旨在打造一种兼具“强力抓捕”、“持续巡航”和“内部维稳”能力的“全能卫士”。

研究人员开展这项研究运用了几个关键的技术方法。在分子设计层面，他们采用了基于结构的蛋白质工程策略，包括利用AlphaFold3（AF3）进行蛋白-蛋白复合物的结构预测，以指导不同模块间的连接子（linker）设计。在蛋白生产与表征上，研究团队通过哺乳动物细胞（CHO细胞）的瞬时转染表达系统大量生产了多种融合蛋白变体，并利用串联亲和层析（如金属螯合层析和Strep-Tactin层析）进行纯化，随后通过UPLC-SEC/MALS（多角度光散射）分析其纯度和寡聚状态。在功能验证方面，他们使用了覆盖多种SARS相关冠状病毒（sarbecovirus）的重组刺突蛋白进行ELISA结合力交叉反应性评估，并利用表达人ACE2/TMPRSS2的HEK293T细胞进行了假病毒中和试验。在体内研究环节，他们使用了多种啮齿类动物模型：在Wistar大鼠中进行药代动力学（PK）研究，在叙利亚仓鼠中进行SARS-CoV-2活病毒感染的体内中和效力评估，并在CD-1小鼠（包括正常血压和由血管紧张素II诱导的高血压模型）中评估了心血管保护效果。

研究结果：

融合设计：

研究人员设计了一种三模块融合蛋白，其通用结构为VHH_Spike-ACE2_ECD-VHH_Albumin。其中，VHH_Spike是靶向病毒刺突蛋白不同区域（如受体结合域RBD、N端结构域NTD或S2区域）的高亲和力、广谱单域抗体（纳米抗体）；ACE2_ECD是完整的人源ACE2受体胞外域，可非共价同源二聚化并保留酶活性；VHH_Albumin是结合血清白蛋白的纳米抗体，旨在延长药物在血液循环中的半衰期。各模块之间通过灵活的甘氨酸-丝氨酸（Gly-Ser）连接子相连。

表达、纯化和表征：

研究成功在CHO细胞中表达了三种融合蛋白变体（72opt-ACE2-R28, S2A3-ACE2-R28, SR01-ACE2-R28）及对照蛋白。纯化后的蛋白主要是二聚体形式，纯度较高。分子量分析证实了其预期的二聚体结构。

结合交叉反应性：

通过对30种冠状病毒（涵盖SARS-CoV-2、SARS-CoV及相关动物冠状病毒）的重组刺突蛋白进行ELISA检测，发现所有三种融合蛋白都比仅含ACE2模块的对照蛋白具有更广泛的交叉反应性。其中，结合RBD的72opt-ACE2-R28融合蛋白结合谱最广，而结合NTD的SR01-ACE2-R28对某些奥密克戎（Omicron）变异株显示出最强的结合力。

假病毒中和：

体外假病毒中和实验表明，针对原始毒株、德尔塔（Delta）和奥密克戎B.1.1.529毒株，72opt-ACE2-R28的中和效力最强，其半数抑制浓度（IC₅₀）达到了皮摩尔（pM）级别。对于奥密克戎BA.4/5毒株，SR01-ACE2-R28表现出最强的中和能力。所有融合蛋白的中和效力均优于不含有VHH_Spike模块的对照蛋白。

药代动力学：

在大鼠体内进行的药代动力学研究表明，含有白蛋白结合模块R28的72opt-ACE2-R28，其血清暴露量（AUC）是缺乏该模块的对照蛋白的2.8倍，证实了VHH_Albumin模块可有效延长药物在血液循环中的时间。

体内病毒中和效力：

在仓鼠感染模型中，单次静脉注射10 mg/kg的72opt-ACE2-R28，能够显著减轻感染仓鼠的体重下降，并在感染后第5天，大幅降低其肺组织中的SARS-CoV-2核衣壳蛋白含量，显示出强大的体内病毒清除能力。

体内血压效应：

在正常血压小鼠中，单次注射72opt-ACE2-R28可引起收缩压持续4天的适度下降（约15 mmHg）。在通过持续输注血管紧张素II建立的高血压小鼠模型中，单次注射该融合蛋白能在4小时内将异常升高的收缩压（约160 mmHg）迅速降至正常水平（约100 mmHg），效果可持续24小时。整个实验过程中，未观察到明显的体重下降或尿蛋白增加等毒性迹象。

研究结论与讨论：

本研究表明，VHH_Spike-ACE2_ECD-VHH_Albumin这一新型分子设计成功整合了三大功能：通过VHH_Spike模块实现对sarbecovirus的广谱、强效中和；通过ACE2_ECD模块提供外源性酶活性，以对抗感染导致的ACE2下调及相关心血管并发症；通过VHH_Albumin模块延长体内半衰期，优化药代动力学特性。这种“即插即用”的模块化设计，允许根据流行病毒株的变化，更换或优化其中的VHH_Spike模块，以应对未来的病毒变异逃逸，而ACE2_ECD模块则始终能提供一个针对所有SARS相关冠状病毒的基础结合与中和“保底”能力。在安全性方面，该设计避免了使用传统的免疫球蛋白Fc片段，从而可能降低由Fc受体介导的潜在免疫副作用风险。

该研究在概念验证层面取得了鼓舞人心的成果，证明了这种以ACE2为核心的多功能支架在治疗急性SARS-CoV-2感染及相关心血管损伤方面具有巨大潜力。它不仅为解决新冠病毒的“抗病毒”与“治并发症”双重挑战提供了一种创新思路，其模块化、可定制的设计理念也为未来应对其他新发突发传染病提供了有价值的技术平台。当然，要将该技术推向临床，还需在规模化生产、长期毒性及免疫原性等方面进行更深入的研究。