开发用于定量测定人血清中semaglutide的电化学发光免疫分析法

《Analytical Biochemistry》：Development of an Electrochemiluminescence Immunoassay for Quantitative Determination of Semaglutide in Human Serum

建立高灵敏度电化学发光免疫分析法用于人血清中司美格鲁肽的定量检测，该方法采用自行筛选的高特异性单克隆抗体对，在0.5-200.0 ng/mL范围内满足精密度≤14.4%、准确度-12.5%至15.3%等验证要求，成功克服LC-MS/MS法通量低、灵敏度不足的局限，为临床生物分析提供可靠工具。

　　

罗一凡|张俊彦|陈文龙|张和风|邹玲龙

中国浙江省温州市温州医科大学，邮编325024

摘要

索马鲁肽（Semaglutide）是一种长效的胰高血糖素样肽-1受体激动剂（GLP-1RA），广泛用于2型糖尿病和肥胖症患者的治疗。在临床研究中，对索马鲁肽进行敏感可靠的定量分析至关重要。为了开发一种灵敏且特异的免疫测定方法，我们制备了一对高特异性的抗索马鲁肽单克隆抗体，并将其作为关键试剂，用于开发电化学发光免疫测定（ECLIA）技术，以测定人血清中的索马鲁肽水平。本研究的验证数据表明，ECLIA方法在0.5 ng/mL至200.0 ng/mL的定量范围内，所有验证参数均符合预设标准。该方法的内部和外部精密度（%CV）均≤14.4%，准确度（%RE）在?12.5%至15.3%之间。未发现重组人GLP-1对测定结果产生干扰，从而证实了其特异性。其他测定性能参数，包括选择性、稀释线性、钩效应和样品稳定性，也均符合国际生物分析方法验证指南的要求。该方法适用于人血清中索马鲁肽的生物分析。

引言

胰高血糖素样肽-1（GLP-1）对葡萄糖代谢的调节至关重要，但由于其半衰期较短，容易被酶快速降解，因此其治疗应用受到限制[1]、[2]。索马鲁肽等GLP-1类似物的出现，彻底改变了2型糖尿病和肥胖症的治疗格局[3]、[4]。随着生物制药行业开发出成本效益更高的索马鲁肽仿制药或继续研发基于肽类的治疗方式[5]，建立适用于这些药物的生物分析方法变得至关重要。

液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）技术已被用于人血浆中索马鲁肽的生物分析，但在某些情况下其分析灵敏度不足[6]。此外，该技术需要复杂的样品制备过程，并依赖昂贵的仪器设备，分析通量有限。由于免疫测定方法在大分子生物制品分析中具有更高的灵敏度和通量[7]、[8]，因此我们选择了免疫测定方法来测定索马鲁肽。基于钌（Ru）标记系统的电化学发光（ECL）技术在内的免疫测定技术最新进展，为开发高灵敏度测定方法提供了巨大潜力。特别是对于需要高分析通量、高灵敏度（≤1.0 ng/mL）或分析少量样品的应用场景，ECL方法能够有效克服LC-MS/MS技术的局限性。与传统比色免疫测定相比，基于ECL的免疫测定（ECLIA）具有更高的分析灵敏度、更宽的定量范围和更好的样品分析通量[9]。因此，在本研究中，我们根据现行的生物分析指南[10]、[11]，开发并验证了一种用于索马鲁肽生物分析的ECLIA方法。

材料

抗索马鲁肽单克隆抗体、辣根过氧化物酶（HRP）标记的抗索马鲁肽单克隆抗体、CRIVVIN? ECL标准板、CRIVVIN? SULFO-Ru标记试剂盒、CRIVVIN?酪蛋白阻断剂和CRIVVIN?读数缓冲液（4倍浓度）均由温州KanryBio生物技术有限公司（中国浙江）提供。索马鲁肽和重组人GLP-1(7-36)酰胺蛋白分别购自诺和诺德公司（丹麦哥本哈根）和基因斯派克生物技术有限公司（中国江苏）。

抗体对筛选

小鼠抗索马鲁肽单克隆抗体（克隆MB01–MB04）是通过杂交瘤技术制备的。在筛选抗体对之前，首先评估了这四种单克隆抗体的滴度。如图2A所示，所有单克隆抗体的滴度均超过1:10,000，表明它们对索马鲁肽具有高亲和力。从12种组合中筛选出了最佳的抗体对（见图2B）。通过比较各组合的信噪比（S/N），选择了具有最高

讨论

尽管索马鲁肽及其仿制药候选物在临床试验中得到了积极研究，但其生物分析方法仍存在一些局限性。在分析技术方面，LC-MS/MS是主要的索马鲁肽定量方法，但其应用范围有限，缺乏其他可供选择的分析技术来补充LC-MS/MS方法。LC-MS/MS方法的缺点包括通量低、灵敏度相对较低等。

结论

本研究成功开发了一种用于人血清中索马鲁肽定量测定的ECLIA方法。该方法在0.5–200.0 ng/mL的定量范围内表现出良好的灵敏度、精密度、准确度和特异性，符合所有验证标准。该方法对于临床研究中索马鲁肽的定量分析具有重要的价值。

作者贡献声明

罗一凡：撰写 – 审稿与编辑、初稿撰写、数据可视化、方法验证、软件应用、数据分析。张俊彦：方法验证、实验设计。邹玲龙：撰写 – 审稿与编辑、项目监督、概念构思。陈文龙：方法验证、实验设计。张和风：撰写 – 审稿与编辑、项目监督

利益冲突声明

作者声明不存在任何可能影响本文研究的已知财务利益或个人关系。

资助

本研究得到了中国科学院温州研究院的支持 [资助编号：WIUCASQD2022022]。

利益冲突声明

作者声明不存在任何可能影响本文研究的已知财务利益或个人关系。