虾类微孢子虫Ecytonucleospora hepatopenaei（EHP）的极管发射动态与超微结构研究

《Aquaculture》：Polar tube firing dynamics and ultrastructure from the shrimp microsporidian Ecytonucleospora hepatopenaei (EHP)

EHP极管发射机制研究显示，KHP在pH3.0时触发率最高，激活需≥30秒，温度25-28°C最适，高速成像和高分辨电镜揭示其发射动力学及结构特征。

　　

Nutthapon Sangklai | Thanamon Udomphonphaibun | Krittapron Keawpanya | Paris R. Watson | Nicolas Coudray | Maia A. Koliopoulos | Orawan Thepmanee | Arun K. Dhar | Damian C. Ekiert | Gira Bhabha | Anchalee Tassanakajon | Pattana Jaroenlak

泰国曼谷朱拉隆功大学生物化学系分子生物学与基因组学卓越中心

摘要

Ecytonucleospora hepatopenaei（简称EHP）是一种属于微孢子虫门的专性细胞内寄生虫。EHP感染会导致虾的生长迟缓和体型变异，给全球虾养殖业带来严重经济损失。与其他微孢子虫物种类似，EHP利用一种称为“极管”的鱼叉状侵入装置来感染宿主细胞。极管通常在孢子内部盘绕，在适当刺激下会迅速伸展成细长的管状结构。然而，影响EHP极管发射的机制和物理条件尚不明确。本研究筛选了多种萌发缓冲液，发现含有pH 3.0的邻苯二甲酸钾（KHP）的缓冲液具有最高的极管发射率。EHP的最佳萌发温度范围为25至28°C，与虾的养殖温度相近。孢子需要至少30秒才能被激活，这表明刺激物质能够快速穿透孢子壁。我们利用高速活细胞成像技术研究了EHP极管的发射动态，并比较了用KHP和另一种已报道的刺激物质（邻苯胺蓝B）处理后的差异。结果显示，在KHP条件下，极管的发射总时间约为100毫秒，最大发射速度约为300 μm·s^?1。进一步通过冷冻电子显微镜观察EHP极管的超微结构发现，其外表面存在一层膜以及重复排列的蛋白质结构，这些重复单元可能是极管蛋白（PTPs）。总体而言，本研究为理解EHP极管发射的生物学机制及其结构提供了重要线索，有助于开发控制EHP的策略。

引言

Ecytonucleospora (Enterocytozoon) hepatopenaei（简称EHP）是虾养殖业中重要的寄生虫，是引起肝胰腺微孢子虫病（HPM）的病原体（Thitamadee等人，2016年）。HPM的主要症状是虾的生长迟缓，导致体型差异（Tourtip等人，2009年）。虽然严重的EHP感染不会导致死亡，但会显著降低虾场的生产效率，从而造成重大经济损失（Rajendran等人，2016年；Shinn等人，2018年）。EHP感染还会增加虾对细菌和病毒的易感性（Aranguren等人，2017年；Suryakodi等人，2022年）。EHP的主要感染部位是肝胰腺的管状上皮细胞（Tourtip等人，2009年）。由于肝胰腺是产生多种消化酶、消化食物和吸收营养的重要器官，因此受EHP感染的虾会出现生长异常和迟缓（Chaijarasphong等人，2021年；Kongplong等人，2023年）。 EHP和其他微孢子虫物种在其生命周期中会形成具有环境抗性的孢子。这些孢子配备了一种称为极管的特殊感染结构（Han等人，2020年；Kudo，1918年；Lom，1972年）。在适宜条件下或遇到宿主细胞时，孢子会迅速发射极管。这一过程称为孢子萌发或极管发射（Jaroenlak等人，2022年；Frixione等人，1992年）。极管能够穿透宿主细胞膜，将感染性物质传递到宿主体内（Jaroenlak等人，2020年）。不同微孢子虫物种的孢子萌发触发条件各不相同，例如Encephalitozoon spp.可通过过氧化氢（H₂O₂）触发（Weiss等人，2014年），而Nosema spp.则常由脱水和pH变化触发（Weiss等人，2014年）。对于EHP，已报道红色水溶性染料邻苯胺蓝B可以引发极管发射（Aldama-Cano等人，2018年）。多项研究表明，孢子萌发需要多种因素，如pH变化（Ishihara，1967年；Undeen和Epsky，1990年；Omrani等人，2023年）、单价阳离子（Frixione等人，1994年）、温度（Imura等人，2023年）和盐浓度（Frixione等人，1994年）。需要注意的是，由于缺乏针对不同微孢子虫物种的系统性研究，目前尚不清楚这些因素的通用性。因此，极管发射的机制仍不甚明了。 在触发极管发射的各种因素中，pH似乎是最常见的因素。适宜的pH值可提高孢子萌发率（Ishihara，1967年；Pleshinger和Weidner，1985年）。许多微孢子虫物种在中性pH到碱性pH的转变下即可萌发，例如Glugea hertwigi在pH变化1–2个单位时开始萌发（Weidner和Byrd，1982年）。相反，Parathelohania iranica的极管发射需要pH从7.0变为11.0（Omrani等人，2023年），而Nosema pulicis和Pleistophora anguillarum则需要pH从中性变为酸性（Korke，1916年；Hashimoto等人，1976年）。此外，Vavraia culicis的极管发射与pH无关，因为其孢子在酸性和碱性条件下都能被激活（Albert H. Undeen，1983年）。尽管如此，pH的作用机制仍需进一步研究，通常需要与其他刺激因素（如离子）结合分析。 碱金属离子（如Na⁺和K⁺）也是孢子萌发的重要因素。多项研究探讨了金属离子的触发作用（Frixione等人，1994年；Undeen，1978年；Undeen，1988年；Nakamura等人，2019年）。在Anncaliia algerae（原属于Nosema属）中，碱金属离子的活性顺序为K⁺ > Na⁺ > Rb⁺ > Cs⁺ > Li⁺（Undeen，1988年）。用不透膜的阳离子氯离子替代Na⁺和K⁺会完全抑制孢子萌发（Frixione等人，1994年），重新加入Na⁺和K⁺后萌发得以恢复。这些结果表明，阳离子必须进入孢子才能触发萌发。Na⁺和K⁺等碱金属离子对不同微孢子虫物种的萌发影响各不相同。 极管发射过程发生在毫秒级时间尺度上（Jaroenlak等人，2022年），由于其快速性，研究这一过程颇具挑战性。最近的研究利用高速活细胞成像技术分析了四种感染蚊子和人类的微孢子虫的极管发射动力学，包括A. algerae、Encephalitozoon hellem、Encephalitozoon intestinalis（Jaroenlak等人，2020年）和Vairimorpha necatrix（Sharma等人，2024年）。极管发射分为三个阶段：1）极管伸长，2）极管静止期，3）感染性物质或孢子质的释放（Jaroenlak等人，2020年）。在A. algerae中，极管的发射速度可达约230 μm·s^?1，在E. hellem中可达约330 μm·s^?1，足以穿透宿主细胞膜（Chang等人，2023年；Jaroenlak等人，2020年）。即使是在亲缘关系较近的E. hellem和E. intestinalis之间，也观察到了发射速度的差异（Jaroenlak等人，2020年）。 关于影响EHP孢子萌发和极管发射的物理条件知之甚少。本研究探讨了pH、单价阳离子、温度和激活时间对EHP孢子萌发的影响，并利用高速活细胞成像技术观察了极管发射过程及感染物质的运输情况。此外，还通过冷冻电子显微镜观察了发射出的极管结构。这些发现为理解EHP的感染机制提供了新见解，有助于开发防治EHP的方法。

EHP的传播

实验所需的Litopenaeus vannamei幼体由泰国碧差汶府Charoen Pokphand Foods PCL公司的Marine Shrimp Broodstock Research Center II（MSBRC-2）提供。EHP感染虾样本来自泰国东部Chanthaburi省的商业养殖池塘，用于萌发分析；冷冻电镜（cryoEM）样本则来自美国亚利桑那大学图森分校的水产病理实验室。

影响EHP孢子萌发的物理条件

由于邻苯胺蓝B是已知唯一能触发EHP孢子萌发的化学物质（Aldama-Cano等人，2018年），我们筛选了pH范围为2.0–14.0的多种萌发缓冲液（详见方法部分，补充图S1）。结果表明，EHP孢子在两个特定pH范围内萌发效果最佳（图1A）。有趣的是，EHP孢子在酸性pH下更易萌发。含有100 mM邻苯二甲酸钾（KHP）且pH为3.0的萌发缓冲液表现出最高的萌发效率。

讨论

极管萌发是启动微孢子虫感染的关键步骤。不同微孢子虫物种所需的萌发条件差异很大（Han等人，2020年）。本文描述了EHP孢子的体外萌发条件，并详细分析了极管发射的机制（图6）。首先，邻苯二甲酸、K⁺和pH 3.0是EHP孢子萌发的必要条件。

作者贡献声明

Nutthapon Sangklai：撰写 – 审稿与编辑，初稿撰写，方法学设计，实验设计，数据整理。 Thanamon Udomphonphaibun：实验设计，数据分析。 Krittapron Keawpanya：实验设计，数据分析。 Paris R. Watson：撰写 – 审稿与编辑，方法学设计，数据分析。 Nicolas Coudray：撰写 – 审稿与编辑，数据可视化，方法学设计。 Maia A. Koliopoulos：撰写 – 审稿与编辑，资源协调，方法学设计。

资助信息

本项目由朱拉隆功大学Ratchadaphiseksomphot捐赠基金资助（项目编号：RCU_69_018_2300_008）。NS获得了朱拉隆功大学第二世纪基金（C2F）和朱拉隆功大学90周年纪念基金（Ratchadaphiseksomphot捐赠基金的博士奖学金。

< />

Seneviratne等人，2023年 Sharma等人，2023年 Zhang，2016年 Zheng等人，2017年

< />

作者声明以下可能的利益冲突： Pattana Jaroenlak表示获得了泰国国家研究委员会的财政支持。其他作者声明没有已知的可能影响本文研究的财务利益或个人关系。

< />

冷冻电镜数据采集于约翰霍普金斯大学的Beckman冷冻电镜中心。感谢Kai Cai、Dazhong Ding和Duncan Sousa在项目规划和数据收集方面的协助。冷冻电镜数据的处理工作在Hopkins大学的先进研究计算（ARCH）核心设施完成（rockfish.jhu.edu），该设施得到了美国国家科学基金会（NSF）的资助（项目编号：OAC1920103）。