《Aquaculture》：Targeted gene delivery in cyprinid fish oocytes mediated by VtgN: A strategy for fish genetic manipulation
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靶向递送技术在鱼类中的应用存在效率低、特异性差等问题。本研究通过系统发育分析和3D结构建模，鉴定了鲤科鱼类Vitellogenin（VtgN）N端保守的8氨基酸受体结合位点，构建了VtgN介导的卵靶向递送系统，成功在cyp19a1a?/?全雄性鱼中实现功能恢复，验证了该系统的安全性和高效性，为水产养殖单性繁殖和功能基因组学研究提供新工具。
Jing Huang | Yunpeng Fan | Mingui Jiang | Xing Guo | Guangjing Zhang | Kaiyue Zhao | Hanqi Xiao | Liangyue Peng | Wen Fu | Jinhui Liu | Wenbin Liu | Yamei Xiao
湖南师范大学生命科学学院，中国长沙410081
摘要
靶向递送技术由于其高效性、强特异性和可靠的生物安全性而具有显著的技术优势。然而，其在水生物种中的应用仍然有限。在本研究中，我们鉴定了鲤科鱼类卵黄蛋白（VtgN）N端结构域中的一个保守的受体结合位点，并建立了一种针对卵巢的递送系统。利用VtgN介导的递送方法，我们成功地在全雄性的cyp19a1a?/?群体中诱导出了具有功能的雌性个体。这些发现为鱼类遗传操作提供了一种新型、安全且可控的策略。此外，这种方法在水产养殖中的单性繁殖和功能基因组学研究方面具有巨大潜力。
引言
近年来，基因编辑技术的显著进步为鱼类遗传改良和生物研究带来了前所未有的机遇（Lu et al., 2021; Wang et al., 2025; Zhu et al., 2024）。传统技术受到递送效率低、特异性差和操作程序复杂的限制（Bussmann and Schulte-Merker, 2011; Hoshijima et al., 2016; Kawahara et al., 2016; Li et al., 2021; Wang et al., 2024）。目前，靶向递送技术因高效性、强特异性和可靠的生物安全性而在精准医学和生物工程领域受到越来越多的关注。然而，在鱼类中，靶向递送技术（如病毒载体、脂质体、细胞穿透肽、iTOP、外泌体、电穿孔）的效果不佳或成本过高（D'Astolfo et al., 2015; Gehl, 2003; Gupta et al., 2005; Wang et al., 2019; Xu et al., 2009）。鱼类基因编辑仍面临重大挑战，尤其是在特定组织或器官中实现精确的靶向基因编辑方面。
卵巢是调控生殖的关键器官。将外源分子注射到母鱼的卵巢中可以将其传递给受精卵，但未能实现高效的基因编辑（Iwaizumi et al., 2021）。针对卵巢的基因编辑有助于深入分析鱼类的生殖内分泌机制（Li and Ge, 2020）。Chaverra-Rodriguez等人开发了一种名为Receptor-Mediated Ovary Transduction of Cargo (ReMOT Control)的技术，通过成年雌性蚊子的胸腔注射将Cas9核糖核蛋白（RNP）递送到节肢动物的生殖细胞中（Chaverra-Rodriguez et al., 2018）。卵黄蛋白（Vtg）是一种关键的卵黄前体蛋白，在肝脏中合成后通过卵黄蛋白受体（VtgR）特异性运输到卵巢（Deeley et al., 1975; Matsuda et al., 2011）。此前尝试在硬骨鱼类中应用受体介导的卵母细胞靶向技术（包括使用Vtg信号肽驱动的蛋白质递送）未能实现功能性的基因编辑或表型恢复（Murakami et al., 2019）。
为了解决这一难题，我们通过分子建模（图S1）尝试建立一种针对鱼类卵巢的递送系统。首先，我们对32种硬骨鱼类进行了系统发育分析，确定了VtgN结构域中一个进化上保守的8个氨基酸组成的受体结合基序。其次，我们构建了一种截短的VtgN-EGFP融合蛋白，该蛋白能够在鲤科鱼类中实现卵母细胞的靶向递送。此外，利用这种靶向递送方法成功地将斑马鱼cyp19a1α的纯雄性突变体转变为雌性。这项研究不仅证实了Vtg介导的递送系统在鱼类中的有效性，还为鱼类遗传改良提供了有价值的工具。
实验方法片段
伦理声明
动物采样和实验方案已获得中国湖南师范大学生物医学研究伦理委员会的批准，批准编号分别为4237（2018）和2025-99（2025）。
实验鱼类
气泡眼金鱼（Carassius auratus）和苦鳊（Rhodeus ocellatus）从当地宠物店购买。其他鱼类，如斑马鱼（Danio rerio）、普通鲤鱼（Cyprinus carpio）和鲫鱼（Carassius carassius），则来自多倍体鱼类工程研究中心。
通过系统发育和结构方法鉴定VtgN中的保守受体结合位点
利用Phyre2平台，我们对斑马鱼的Vtg及其受体（VtgR）进行了3D结构建模（图1A,B），发现Vtg和VtgR之间存在二聚体相互作用（图1C）。基于来自不同动物物种的32个Vtg序列，我们使用MEGA X软件构建了系统发育树。在Vtg（VtgN）的N端氨基酸序列中，结合区域（包含8个氨基酸）显示出显著的序列保守性，尤其是在鲤科鱼类中。
讨论
在本研究中，我们鉴定了鲤科鱼类Vtg N端结构域中一个保守的8个氨基酸组成的受体结合基序，并建立了一种基于VtgN的靶向递送系统，用于特异性地向卵母细胞递送物质。我们的核心发现表明，所制备的VtgN-EGFP在体外和体内多个鲤科鱼类中均能实现高效的卵母细胞靶向递送。利用这种VtgN介导的cyp19a1a（编码雌激素生物合成中的关键酶芳香化酶）递送方法，我们成功实现了基因功能的恢复。
CRediT作者贡献声明
Jing Huang：撰写初稿、方法学设计、实验研究、数据分析、数据管理。
Yunpeng Fan：撰写初稿、实验研究、数据分析。
Mingui Jiang：实验研究、数据分析。
Xing Guo：实验研究、数据分析。
Guangjing Zhang：数据分析。
Kaiyue Zhao：数据分析。
Hanqi Xiao：数据分析。
Liangyue Peng：方法学设计。
Wen Fu：数据分析。
Jinhui Liu：数据分析。
Wenbin Liu：数据分析。
Yamei Xiao：撰写初稿。
作者声明
提交本手稿时，我们确认该手稿尚未在其他地方发表、接受发表或处于其他地方的编辑审查阶段；同时，湖南师范大学生命科学学院多倍体鱼类繁殖与育种工程研究中心的代表也完全知晓此次提交情况。
所有作者均已阅读论文并同意将其姓名列为共同作者。
致谢
本研究得到了国家自然科学基金（U23A20246）、国家重点研发计划（2018YFD0901202）以及湖南省研究生科学研究创新项目（CX20240543和CX20250783）的支持。作者衷心感谢Zeng Zhiqiang博士在本研究过程中的宝贵支持，同时也感谢审稿人对论文提出的建设性意见，这些意见极大地促进了论文的完善。
