利用基于深度学习的自动浮萍计数方法快速评估水生生态系统中的农药毒性

《Aquatic Toxicology》：Rapid Assessment of Pesticide Toxicity in Aquatic Ecosystems Using Deep Learning-Based Automatic Duckweed Counting Method

农药对水绵生长抑制的自动化评估与毒性分级。通过优化基于StarDist技术的自动化水绵叶片计数方法，测试28种农药的半数抑制浓度（IC50），发现百草枯（IC50<10 ppb）和丁草胺（IC50=384.2 ppb）毒性最强，草甘膦等5种较低毒，甲霜灵（IC50≈924.3 ppb）为唯一杀菌剂显毒，8种杀虫剂IC50>10^6 ppb。研究构建了深度学习驱动的全自动化分析平台，显著提升毒理学评估效率。

　　

唐纳德·程（Donald Cheng）| 凯文·阿迪·库尔尼亚（Kevin Adi Kurnia）| 钟德浩（Chung-Der Hsiao）

台湾中兴基督大学化学系，中兴市

摘要

农药在农业中被广泛使用，以控制威胁作物产量的杂草、昆虫和病害。然而，其大量使用引发了人们对环境影响的担忧，尤其是在水生生态系统中，这些生态系统容易受到径流和渗漏的污染。为了评估农药对水生植物的毒性，我们应用了一种基于StarDist技术的优化自动化浮萍（Wolffia globosa）叶片计数工具。利用这种方法，我们测试了28种常用的农药（包括除草剂、杀菌剂和杀虫剂）对浮萍生长的影响。除草剂百草枯表现出最强的生长抑制作用（IC₅₀ < 10 ppb），其次是敌草隆（IC₅₀ = 384.2 ppb）。西玛津和苯丁津表现出中等毒性，而草甘膦、三氯吡氧乙酸和草铵膦的毒性较低。令人惊讶的是，即使在最高测试浓度（10⁶ ppb）下，甲基异硫磷也没有抑制浮萍的生长。异丙硫醇烷是唯一一种对浮萍表现出显著毒性的杀菌剂（IC₅₀ ≈ 924.3 ppb）。其他所有杀菌剂（包括吡唑醚菌酯、己唑醇、氟环唑、吡唑醚菌酯、戊唑醇和环唑醇）只有在异常高的浓度下才会抑制植物生长。有趣的是，在测试条件下，氰氟草胺反而促进了浮萍的生长。在测试的12种杀虫剂中，有8种对浮萍的毒性相对较低（IC₅₀ > 10⁵ ppb）。氰氯菊酯、克百威、芬普罗帕丁和尼丁吡胺的毒性非常低，其IC₅₀值超过10⁶ ppb）。我们的研究结果不仅增进了对农化品毒性的理解，还展示了自动化、高通量量化W. globosa生长的实用性，为水生环境中农药毒性评估提供了一种快速有效的方法。

引言

过去几十年里，人口快速增长、气候变化以及农业系统的发展极大地增加了全球对食物的需求（Manida）。在热带和亚热带地区，气候条件有利于多种生物的生存，其中包括大量的农业害虫，如昆虫、线虫、啮齿动物、杂草和病原真菌，这对作物产量构成了挑战。自20世纪中叶以来，农药被广泛用于控制这些有害生物，显著提高了产量并保障了全球粮食安全（OECD）。

尽管农药在农业中具有积极作用，但许多研究强调了它们对非目标生物的负面影响。农业工人和儿童由于接触农药而特别容易受到急性和慢性健康问题的影响。为应对这些问题，各国开始加强农药使用的监管，并推广替代性害虫管理方法，以减少对化学农药的依赖（欧洲委员会）。然而，由于需要在不断增长的粮食需求和气候压力下维持作物生产，全球农药市场仍在继续扩大（OECD）。

农药使用的担忧不仅限于人类，环境污染问题也在加剧，尤其是在水生生态系统中。农药可以通过径流、喷雾漂移和渗漏进入地表水和地下水，破坏生态平衡并引入有毒物质（Stehle）。因此，迫切需要开发快速、灵敏且可靠的筛选方法来评估环境中的农药毒性，以改善生态风险评估并支持可持续的农药管理。

在水生初级生产者中，浮萍（ Lemnaceae科）已成为生态毒性测试的有效模式生物。该科包括五个属——Lemna、Spirodela、Wolffia、Wolffiella 和 Landoltia，它们是常见于水流缓慢或静止淡水系统中的小型浮游植物。它们简单的形态、快速的无性繁殖以及对污染物的高敏感性使其成为评估植物毒性的理想选择（Test No. 221: Lemna sp, 2006, Forni and Tommasi, 2015）。W. globosa L.（亚洲水田芥）是地球上最小的开花植物（通常小于1毫米），由一个无根的叶状体组成，能够均匀接触化学物质并直接吸收污染物。在最佳条件下，其繁殖周期仅为1-2天，非常适合进行短期、高通量的毒性测定，如数量、表面积和生长抑制的量化（bog et al., 2019, thingujam 2024）。先前的研究表明，W. globosa具有显著的金属吸收能力，可以积累超过1000 mg.kg?1干重的砷（Zhang et al., 2009）以及高水平的铬和镉（Grag and Chandra, 1994）。它还被用于评估药物、稀土元素和农药的毒性（Kurnia et al., 2023, Zou et al., 2016, Turgut et al., 2003）。除了生物学优势外，W. globosa的均匀形态和缺乏根系使其适合基于图像的表型分析。这些特性减少了图像噪声，通过计算机视觉实现了精确、自动化的量化，为环境毒性评估提供了一个客观、可重复和可扩展的平台。

传统上，浮萍毒性的评估依赖于手动或半手动叶片计数，这一过程耗时且容易出错。然而，计算机视觉和深度学习的最新进展改变了这一领域，使得基于图像的植物分割和生长监测实现了高通量和自动化。其中，StarDist神经网络最初是为在显微镜图像中检测星形凸物体而开发的，基于U-net架构，它在识别和计数小型、重叠的生物结构方面表现出卓越的准确性（Schmidt et al., 2018）。由于其能够处理密集排列和形状不规则的物体，该网络特别适合分析在快速生长过程中经常重叠的浮萍叶片。在我们之前的工作中，我们实现了一种基于StarDist的半自动化方法来量化W. globosa在稀土元素作用下的生长抑制（Kurnia et al., 2023）。在此基础上，本研究将StarDist图像分析流程完全自动化，并将其整合到ImageJ的Python脚本中，实现了批量处理。这一进步将工作流程从半自动化转变为全自动操作，消除了检测、计数和生长率计算等手动步骤。改进后的系统显著提高了可重复性，减少了分析时间，并实现了大规模、高通量的化学毒素在水生植物模型中的筛选。

利用升级后的系统，我们测试了27种常见的农药（包括除草剂、杀菌剂和杀虫剂），以评估它们对W. globosa生长的抑制作用。通过结合基于深度学习的图像分割、自动化Python分析和非线性剂量-反应建模，该方法能够快速、客观地确定IC??值。这些发现为农药风险评估提供了重要的生态毒性数据，并强调了基于深度学习的自动化作为一种快速、准确且可扩展的工具，用于评估水生毒性。

实验流程概述

浮萍培养

W. globosa样本购自台湾新北市的当地农场市场。样本在生长培养基中维持，该培养基由Hyponex No. 4肥料（Hyponex Japan Co., Ltd., 大阪，日本）与ddH₂O按1:20,000的比例稀释后，放置在不锈钢托盘中，实验室条件为：温度30°C，16:8的光暗周期，光照强度8000勒克斯。浮萍在实验室条件下适应至少四天后开始实验。

实验工作流程概述

基于之前的研究，本研究选择StarDist作为计数浮萍叶片的方法。训练数据集是通过在QuPath中进行手动注释获得的，记录了在6孔微孔板中培养的W. globosa的八张图像。我们将原始的多步骤过程改进为一次点击即可完成的流程。

获得最佳模型后，...

结论

在这项研究中，我们开发并验证了一个完全自动化的深度学习流程，用于量化Wolffia globosa在农药作用下的生长抑制情况。我们训练了一个针对W. globosa的StarDist模型，并将其整合到Python分析模块中，将原本半自动的工作流程转变为一个完全自动化、高通量且可重复的系统，用于水生毒性筛选。这种方法减少了人工干预，降低了计数错误，并提高了分析效率。

作者贡献

概念构思：D.C.、C.-D.H.；数据整理和正式分析：D.C.、K.A.K.；资金获取：C.-D.H.；方法论：K.A.K.；监督：C.-D.H.；撰写原始草稿：D.C.、C.-D.H.

资金支持

本研究得到了国家科学技术委员会（113-2313-B-033-001-MY3）的资助。

CRediT作者贡献声明

唐纳德·程（Donald Cheng）：撰写原始草稿、正式分析、概念构思。 凯文·阿迪·库尔尼亚（Kevin Adi Kurnia）：软件开发、资源准备、方法论设计。 钟德浩（Chung-Der Hsiao）：撰写原始草稿、监督、项目管理、资金获取、概念构思。