《Archives of Biochemistry and Biophysics》：Synergistic Effects of CAR-Modified Mesenchymal Stem Cells and MGST1 Activation in Facilitating Myocardial Tissue Repair Post-Ischemia-Reperfusion Injury
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心肌缺血再灌注损伤中，LRP6靶向的CAR-MSCs联合MGST1过表达通过激活Nrf2/Keap1通路显著减轻氧化应激、抑制细胞凋亡，并促进修复因子分泌，在细胞和动物模型中均显示协同疗效。
杨阳|李晨璐|卢子旺|曹先通|吴启飞
西安交通大学第一附属医院心血管外科，中国西安710061
摘要
心肌缺血-再灌注（I/R）损伤仍然是一个主要的临床挑战，它削弱了再灌注治疗的好处，并导致了不良的心脏重塑。尽管间充质干细胞（MSCs）具有再生潜力，但其治疗效果受到较差的植入率和在缺血条件下低存活率的限制。为了解决这些限制，我们开发了一种组合策略，利用低密度脂蛋白受体相关蛋白6（LRP6）靶向的嵌合抗原受体工程化MSCs（CAR-MSCs）来增强对受损心肌的特异性归巢能力，并通过过表达微粒体谷胱甘肽S-转移酶1（MGST1）来加强细胞的抗氧化防御。我们在I/R损伤的细胞和动物模型中评估了这种方法。在体外，缺氧-葡萄糖剥夺/再氧化（OGD/R）条件下，单独使用MSCs、CAR-MSCs或过表达MGST1都能减轻OGD/R引起的损伤。未修饰的MSCs与MGST1过表达的组合（MSCs+MGST1）进一步提高了细胞活力并减少了凋亡。值得注意的是，CAR-MSCs和MGST1过表达的组合（CAR-MSCs+MGST1）表现出最显著的保护效果，在提高细胞活力、减少凋亡和细胞内活性氧（ROS）水平、调节氧化应激标志物（MDA、SOD、CAT）以及促进修复性生长因子（VEGF、IGF-1、HGF）的分泌方面显著优于其他所有组。在大鼠I/R模型中，联合治疗显著减少了梗死面积，改善了组织损伤，减少了胶原沉积和凋亡，并持续调节了血清中的氧化和再生生物标志物。机制上，联合干预激活了Nrf2/Keap1信号通路，上调了下游效应因子NQO1和HO-1。Nrf2的抑制部分消除了这种心脏保护作用。总之，LRP6靶向的CAR-MSCs与MGST1过表达相结合，通过激活Nrf2/Keap1抗氧化程序提供了协同保护，对抗I/R损伤，为提高精准MSC治疗和减轻再灌注引起的心脏损伤提供了一种临床可行的策略。
引言
心肌梗死（MI）仍然是全球死亡和残疾的主要原因[1]。及时的再灌注疗法，如经皮冠状动脉介入（PCI），是挽救缺血心肌的标准治疗方法[2]。然而，血流的恢复却 paradoxically 触发了缺血-再灌注（I/R）损伤，这种现象导致了PCI后五年内大部分严重的心血管不良事件<3, 4>。I/R损伤由氧化应激、炎症激活、自噬和程序性细胞死亡等机制驱动<5, 6>，这些机制不仅抵消了再灌注的好处，还进一步加剧了组织损伤。此外，I/R损伤显著恶化了临床结果，包括增加心力衰竭和死亡的风险，这是心血管医学中的一个重大挑战[7]。因此，研究其潜在机制并开发针对I/R损伤的保护策略至关重要。
间充质干细胞（MSC）疗法已成为I/R损伤后心肌修复的有希望的再生方法[8]。MSCs具有多向分化能力、强大的免疫调节作用和旁分泌活性<9, 10>。通过分泌各种血管生成因子（例如VEGF和HGF）和抗凋亡分子，它们可以减轻炎症反应，减少纤维化，促进新血管形成，并增强心肌细胞存活<11, 12, 13, 14>。然而，临床应用受到植入效率低下的限制——只有少量的细胞在移植后能够长期存活——以及在恶劣的缺血微环境中的快速细胞死亡<15, 16>。为了改进靶向递送，我们采用了最初为肿瘤学开发的嵌合抗原受体（CAR）技术来改造MSCs[17]。值得注意的是，虽然CAR技术最初是为肿瘤学开发的，但其用途最近已扩展到非肿瘤学领域。Rurik等人证明，在体内递送的成纤维细胞特异性CAR构建体可以将心脏成纤维细胞重新编程为诱导性心肌细胞，并在心肌梗死后改善心脏功能，这是首次证明CAR方法可以安全有效地用于心血管修复[18]。这一策略的成功取决于识别一个在I/R损伤区域高度上调而在健康心肌中表达极低的膜抗原，从而实现CAR-MSCs的精确归巢<18, 19>。此外，低密度脂蛋白受体相关蛋白6（LRP6）是低密度脂蛋白受体（LDLR）家族的成员，是经典Wnt/β-连环蛋白信号通路的重要共受体[20]。现有研究表明，维持或适度增加心肌细胞中的LRP6内源性表达可以显著抑制凋亡，减少梗死面积，并改善心脏功能<21, 22>。在这里，我们旨在用针对LRP6的嵌合抗原受体（CAR）改造MSCs，以生成LRP6靶向的CAR-MSCs，并评估其在I/R损伤后的AMI中的治疗效果。
心肌I/R损伤是一个复杂的病理生理过程，其中氧化应激起着核心作用[23]。虽然血流的恢复至关重要，但它 paradoxically 触发了活性氧（ROS）的爆发，超过了内源性抗氧化防御的能力[24]。这种氧化损伤导致广泛的细胞损伤，包括脂质过氧化、蛋白质变性和DNA损伤，最终促进心肌细胞凋亡和坏死<25, 26, 27>。因此，减轻氧化应激是改善AMI后结果的关键治疗靶点。此外，微粒体谷胱甘肽S-转移酶1（MGST1）在细胞对抗这种氧化损伤中起着关键作用[28]。MGST1属于谷胱甘肽S-转移酶超家族，主要位于内质网和线粒体膜中[29]。它催化谷胱甘肽与多种亲电和疏水性底物的结合，促进其解毒[30]。更重要的是，MGST1在中和脂质过氧化物和减少氧化应激方面发挥着重要作用，从而发挥强大的细胞保护作用[31]。我们之前的研究表明，靶向DNMT1介导的MGST1过度甲基化可以通过减轻线粒体功能障碍和抑制心肌细胞中的铁死亡来改善心脏移植后的心肌I/R损伤[32]。我们提出了一种新的策略，通过工程化CAR-MSCs并过表达MGST1，实现针对梗死心肌的靶向归巢和增强的氧化应激抵抗，从而获得协同治疗效果。通过同时确保精确递送和增强细胞存活，这种方法有望优于单一干预措施，实现更强大的I/R损伤后心脏修复。
在这项研究中，我们揭示了CAR-MSCs和MGST1在心肌I/R损伤中的心脏保护作用。我们的结果表明，在细胞和动物I/R模型中，使用LRP6靶向的CAR-MSCs和MGST1过表达的联合治疗显著减少了心肌梗死、凋亡、氧化应激，并增强了修复性生长因子的分泌。此外，我们发现这种协同心脏保护作用是通过激活Nrf2/Keap1抗氧化通路介导的，因为Nrf2的抑制部分逆转了治疗效果。这些发现为改善I/R损伤后的心肌修复提供了一种新的组合策略。
细胞培养和分离
H9c2心肌细胞（ATCC CRL-1446）在添加了10%胎牛血清（FBS）和1%青霉素-链霉素的高葡萄糖DMEM（Gibco）中培养，温度为37°C，二氧化碳浓度为5%2。对于OGD/R，将70-80%的细胞浓度培养物用PBS洗涤两次，然后在湿润的无氧室（二氧化碳浓度5%，氮气浓度94%）中培养4小时（OGD），随后在正常氧条件下（空气95%，二氧化碳浓度5%）培养24小时进行再氧化。
按照前人描述的方法进行
抗LRP6 CAR-MSCs的构建和MGST1载体的过表达
流式细胞术确认了人类MSCs的成功分离，表明没有表达造血标志物（CD34、CD45），而表达了MSC标志物（CD73、CD90）（图1A）。仅在工程化的CAR-MSCs上检测到anti-FLAG表达，而未转导的MSCs没有信号；两组中的CD73表达保持一致（图1B）。通过Western blot确认了H9c2细胞和MSCs中的MGST1过表达，显示出显著增强的表达
讨论
在这项研究中，我们旨在探讨LRP6靶向CAR-MSCs和MGST1过表达在缓解心肌I/R损伤中的协同治疗效果。结果表明，这种联合干预显著减少了梗死面积、细胞凋亡和氧化应激水平，同时增强了修复性生长因子的分泌。从机制上讲，我们发现这种心脏保护的协同作用是通过
CRediT作者贡献声明
曹先通：研究、数据管理。吴启飞：写作——审阅与编辑、监督、概念化。杨阳：写作——初稿、研究、概念化。卢子旺：方法学、研究、数据管理。李晨璐：方法学、研究、数据管理
伦理批准
我们的研究得到了西安交通大学第一附属医院的伦理委员会的批准，动物实验得到了西安交通大学第一附属医院的动物伦理和实验委员会的批准，并遵守了国际公认的ARRIVE指南。
资金
不适用。
利益冲突声明
作者声明没有利益冲突。
