《Archives of Biochemistry and Biophysics》：Role of HYAL1 on hyaluronan metabolism and the regulation of epidermal tight junction component CLDN1 in HaCaT cells.
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本研究通过处理不同分子量透明质酸（HA）及敲低HA代谢相关因子，利用人表皮角质形成细胞系HaCaT探究HA代谢对表皮屏障功能及紧密连接蛋白claudin-1（CLDN1）表达的影响。结果显示，高分子量HA（HM-HA）通过激活HA降解酶HYAL1降低CLDN1表达，而低分子量HA（LM-HA）无此效应；HYAL1敲低显著抑制HM-HA降解活性并减少HA积累，同时CLDN1表达下降。提示HYAL1介导的HM-HA酸性降解是表皮TJ屏障调控的关键机制，为开发靶向HA代谢的皮肤疾病疗法提供依据。
吉野雄太 | 玄川夏月 | 平尾真依 | 中村宗太 | 田中敏宏 | 宫本千佳 | 内藤智史 | 生垣彰
日本岐阜县岐阜市501-1196，岐阜药科大学生物制药科学系生物化学实验室
摘要
透明质酸（HA）是一种存在于全身组织的多糖，其生理功能取决于其分子量。虽然高分子量的透明质酸（HM-HA）在表皮基底层大量产生，但低分子量的透明质酸（LM-HA）也存在于表皮角质层中，并起到保湿作用。然而，表皮中透明质酸代谢的机制及其生理作用仍不清楚。本研究使用人类表皮来源的HaCaT细胞，探讨了不同分子量的透明质酸处理以及相关代谢因子敲低对表皮屏障功能的影响，该屏障功能由细胞间紧密连接（TJs）介导。同时还研究了负责表皮细胞中透明质酸合成和降解的酶。HM-HA（1,400 kDa）处理降低了作为表皮TJ成分关键蛋白的claudin-1（CLDN1）的mRNA和蛋白质表达；相比之下，LM-HA（3 kDa）处理未观察到此类变化。通过siRNA敲低透明质酸受体CD44后，HM-HA诱导的CLDN1下调现象被抑制。在透明质酸降解酶中，敲低透明质酸酶（HYAL1）降低了降解活性，并通过透明质酸结合蛋白的竞争实验增加了裂解物中的透明质酸含量；HYAL1敲低后CLDN1表达也降低。这些结果表明HYAL1是人类表皮角质细胞中主要的透明质酸降解酶。HYAL1在酸性条件下能降解HM-HA，说明其表达参与TJ屏障的调节。透明质酸的代谢通过HYAL介导，从而影响TJ功能。未来有望开发针对透明质酸代谢的新疗法，用于治疗与TJ屏障功能障碍相关的皮肤疾病。
引言
透明质酸（HA）是一种线性糖胺聚糖，由N-乙酰-D-葡糖胺和D-葡糖醛酸二糖通过β-键交替连接而成。HA是结缔组织细胞外基质（ECM）的主要成分，在皮肤中的含量最高，其次是玻璃体、关节和大脑[1]。多项研究表明，HA参与多种生理功能，如细胞分化、增殖、迁移和血管生成[2]，以及保持细胞间水分和提供缓冲作用[3]。有趣的是，透明质酸的生理功能因其分子量而异：高分子量透明质酸（HM-HA，>1,000 kDa）抑制血管生成[4]、炎症[5]和免疫系统[6]，而低分子量透明质酸（LM-HA，<100 kDa）则促进血管生成[7]，并具有促炎[8]、免疫刺激[6]和抗凋亡[9]作用。透明质酸由存在于质膜中的透明质酸合成酶（HASs）合成[10]。它在体内通过代谢分解为不同分子量。皮肤中HA的半衰期约为1-2天，这得益于透明质酸降解与合成之间的快速平衡[11]。在外周组织中合成的HM-HA会被降解为中等大小的片段（100-1,000 kDa），随后进入淋巴系统，并在肝脏、肾脏和脾脏中进一步降解为单糖[12][13]。尽管透明质酸的降解涉及透明质酸酶（HYAL1/2）[14]、分化簇44（CD44）和透明质酸结合蛋白HYBID（KIAA1199/CEMIP）[15]等因子，但其详细的代谢调控机制尚未完全阐明。
透明质酸分布于皮肤的表皮和真皮层，参与多种皮肤生理过程，维持组织的水分保持和弹性[16]。在真皮层中，HA主要由HAS1/2合成，由HYAL1/2和HYBID降解[15][18]。尤其是真皮层中的透明质酸代谢机制在美容学领域受到关注，因为据报道真皮层中透明质酸含量的减少（由于降解增加）是导致皱纹形成的因素之一。在表皮层中，HA主要由HAS2/3合成[19]，并且角质层（表皮最外层）中的透明质酸分子量较低[11]。然而，表皮层中透明质酸代谢的详细机制及其生理意义仍不明确。
皮肤最重要的功能是作为身体内部与外部的物理屏障[20]。尤其是表皮层在皮肤中起主要屏障作用。表皮角质细胞在相邻细胞间形成紧密连接（TJs），增强皮肤屏障功能，防止外部病原体侵入和体内水分蒸发[21][22]。TJs由跨膜蛋白claudin（CLDNs）、occludin以及zonula occludens（ZO）-1、2和3组成[23]，其中CLDNs是TJ形成的关键成分[24]。目前已发现27种CLDN亚型[25]，CLDN1和CLDN4在人类表皮角质细胞中高表达[26]。CLDN1缺陷小鼠因颗粒层TJ屏障功能受损而在出生后24小时内死亡[27]。启动子区域突变导致的CLDN1表达降低会增加特应性皮炎的风险[28]。这些结果表明CLDN1是维持表皮TJ屏障功能的关键因素。
尽管ECM和保湿因子在维持皮肤屏障功能中的重要性已得到认可，但透明质酸本身对TJ屏障功能的影响尚不清楚。本研究使用人类表皮角质细胞系HaCaT细胞，探讨了透明质酸代谢在细胞增殖和TJ屏障形成等表皮生理功能中的作用。同时还研究了透明质酸的降解活性，以确定表皮角质细胞中透明质酸代谢的主要因素。
材料与方法
人类表皮来源的永生化角质细胞系HaCaT细胞[29]在Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM，Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易斯）中培养，培养基添加了5%胎牛血清（FBS；Sigma-Aldrich）、0.07 mg/mL青霉素G钾和0.14 mg/mL硫酸链霉素，培养条件为5%二氧化碳浓度、37°C。细胞使用0.02%乙二胺四乙酸二钠盐（EDTA）-磷酸盐缓冲液（PBS）和0.5%胰蛋白酶进行传代。
结果
- 不同分子量透明质酸对HaCaT细胞毒性和黏附能力的影响
先前的研究表明，HM-HA抑制细胞增殖，而LM-HA促进细胞增殖[33]。由于细胞对试剂的反应因细胞类型和培养条件而异，我们研究了透明质酸对人类表皮角质细胞系HaCaT的增殖、毒性和黏附能力的影响。
讨论
已有报道指出，透明质酸在表皮基底的干细胞中以HM-HA形式大量合成，并在细胞向角质层分化过程中分子量降低[11]。然而，透明质酸代谢的详细机制及其降低的生理意义仍不清楚。本研究发现，HM-HA处理会降低表皮角质细胞中的CLDN1表达（图2）；敲低HYAL1后，这种抑制作用增强。结论
本研究表明HYAL1是人类表皮角质细胞中主要的透明质酸降解酶。此外，HYAL1在酸性条件下能降解HM-HA，说明其表达参与TJ屏障的调节。进一步阐明透明质酸代谢及HYAL1在表皮中的调节机制，有助于开发维护TJ屏障功能的化妆品和针对相关皮肤疾病的新型疗法。CRediT作者贡献声明
生垣彰：撰写、审稿与编辑、监督。玄川夏月：研究。吉野雄太：撰写、审稿与编辑、初稿撰写、监督、研究、资金获取、数据分析、概念构思。平尾真依：研究。田中敏宏：研究。中村宗太：研究。内藤智史：撰写、审稿与编辑。宫本千佳：研究
资助
本研究部分得到了日本学术振兴会（JSPS）科研费（项目编号23K15290，资助对象Y.Y.）、Smoking Research Foundation（资助编号2023Y010，资助对象Y.Y.）以及日本学术振兴会的Sasakawa科学研究基金（资助编号2022-4018，资助对象Y.Y.）的支持。
利益冲突声明
作者声明本研究未涉及任何可能构成利益冲突的商业或财务关系。
