《Biochemical and Biophysical Research Communications》：Constitutive expression of CX3CR1-BAC-Cre introduces minimal off-target effects in microglia
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CX3CR1-BAC-Cre模型在发育期导致微胶质密度、体积和形态的区域及性别特异性变化，成年后除海马区外均恢复，未发现行为学异常。
Fadya H. Mroue-Ruiz|Bhoomi Desai|Madison M. Garvin|Jonila H. Shehu|Faith Kamau|Urjoshi Kar|Jessica L. Bolton
美国乔治亚州立大学神经科学研究所及神经炎症与心血管代谢疾病研究中心，亚特兰大，GA，美国
摘要
CX3CR1-Cre小鼠品系在理解小胶质细胞生物学方面取得了重要进展。近期研究表明，妊娠期使用他莫昔芬诱导的CX3CR1-Cre表达会对小胶质细胞产生不利影响，这些影响可能包括小胶质细胞密度、表型的变化以及DNA损伤，还可能导致类似焦虑的行为。然而，持续表达CX3CR1-BAC-Cre的意外效应尚未得到充分研究。在本研究中，我们分析了CX3CR1-BAC-Cre表达对CX3CR1-BAC-Cre+/-和CX3CR1-BAC-Cre-/-雄性和雌性小鼠在出生后早期及成年期多个脑区小胶质细胞的影响。此外，我们还进行了类似焦虑的行为测试以评估Cre表达所引起的变化。研究发现，CX3CR1-BAC-Cre表达在发育过程中会导致小胶质细胞密度、体积和形态出现细微的、与区域和性别相关的变化，但这些变化在成年后除海马区外所有脑区均恢复正常。未观察到行为上的变化。我们的研究结果表明，持续表达Cre的模型相比诱导表达的模型危害较小，并强调了进行适当对照实验的必要性。
引言
自从在P1噬菌体中发现Cre重组酶及其能够识别称为loxP位点的DNA序列重复序列的能力后，这一天然存在的病毒系统开始被重新用作研究基因功能的遗传工程工具[1]、[2]、[3]、[4]。早期研究指出，Cre驱动的重组具有高度精确性、保守性，并且不依赖于宿主辅助因子，这引发了大量研究，探索其在各种真核生物中用于切除特定基因的应用。Cre-lox系统在细菌和酵母系统中的初步验证为其在哺乳动物遗传学中的应用奠定了基础[3]、[5]、[6]、[7]。重要的是，这些研究促进了转基因小鼠模型的发展，其中采用了持续敲除和敲低策略[8]、[9]、[10]、[11]。随后，引入了使用他莫昔芬等外源性诱导剂在特定时间点而非整个生命周期内诱导Cre重组酶表达的方法[12]。由此产生了两种主要的Cre-lox介导的基因操作范式：诱导型和持续型模型。
Cre-lox系统现已成为广泛使用的基因编辑工具[5]。该系统需要Cre酶和loxP DNA序列同时存在才能发挥作用。当两者结合时，Cre酶能够识别并切割loxP位点，从而实现精确的基因修饰。诱导型模型在基因操作的时间特异性方面表现出色，而持续型模型则允许Cre重组酶在整个动物生命周期内持续表达。在神经科学领域的小胶质细胞研究中，尤其是利用Cre-lox系统进行了多项重要研究。由于病毒转导小胶质细胞存在挑战[13]、[14]，基于Cre的基因方法已成为该领域常用的策略。
小胶质细胞被称为大脑中的常驻免疫细胞，尽管它们在稳态中也扮演着多种角色，例如在发育过程中参与突触修剪[15]。在中枢神经系统（CNS）实质中，CX3CR1（一种由神经元分泌的配体CX3CL1激活的fractalkine受体）的表达仅限于小胶质细胞/巨噬细胞。Goldmann及其同事是最早成功利用CX3CR1-Cre遗传系统进行体内小胶质细胞靶向研究的团队之一[16]。虽然CX3CR1也表达在脑部的边界相关巨噬细胞以及部分外周巨噬细胞和单核细胞中，但在诱导型模型中，由于小胶质细胞较长的寿命和局部自我更新能力，使其具有相对较高的特异性，而大多数外周髓系细胞则更新较快[16]。因此，许多重要研究依赖于由小胶质细胞/巨噬细胞启动子CX3CR1控制的持续型和诱导型Cre-lox品系来研究和表征小胶质细胞的多种功能[17]、[18]、[19]、[20]。尽管这些研究显著增强了我们对小胶质细胞的了解，但最近的研究表明，在小胶质细胞中使用诱导型CX3CR1-Cre系统可能会产生意外的不良影响。
具体来说，使用他莫昔芬在出生后早期诱导CX3CR1YFP-CreER(Litt) [21]已被证明会对小胶质细胞产生不利影响[22]。研究显示，发育中的Cre+小胶质细胞密度降低、表型改变、吞噬功能增强以及DNA损伤。尽管出生后早期的小胶质细胞数量和表型不规则现象在成年后恢复正常，但这些意外的、非特异性的Cre重组酶表达效应导致成年后动物表现出更强的焦虑行为[22]。另一项研究还报告，在出生后早期诱导CX3CR1YFP-CreER(Litt)后，小胶质细胞中的P2RY12表达显著下降[23]。然而，另一种诱导型Cre品系CX3CR1CreER(Jung)并未引起明显的脱靶效应[23]。有趣的是，这些效应仅限于在CX3CR1启动子下表达的Cre重组酶（即不涉及Tmem119基因）以及仅在出生后早期诱导的情况[22]。
然而，使用细菌人工染色体（BAC）重组策略在CX3CR1启动子下表达Cre的脱靶效应尚未得到充分研究。由于CX3CR1启动子在生成小胶质细胞/巨噬细胞特异性基因操作中的广泛应用，以及最近发现的诱导型Cre重组酶表达的负面影响，迫切需要验证持续型CX3CR1-Cre转基因品系。我们假设，由于其从胚胎阶段到成年期持续不断的表达，持续型CX3CR1-Cre表达也会导致小胶质细胞的形态和功能改变。因此，我们深入分析了持续型CX3CR1-BAC-Cre（来自许多实验室近期使用的GENSAT转基因项目）表达对出生后早期和成年小胶质细胞以及成年小鼠行为的影响。我们的结果以及最新研究对于使用CX3CR1驱动的Cre-lox系统研究小胶质细胞（尤其是在发育过程中）具有重要意义。
实验动物
所有实验均使用了CX3CR1-BAC-Cre [Tg (Cx3cr1-Cre) MW126Gsat]（GENSAT转基因项目[24]）转基因小鼠品系，该品系中的Cre重组酶在CX3CR1启动子控制下持续表达。通过将CX3CR1-BAC-Cre+/-雄性小鼠与CX3CR1-BAC-Cre-/-雌性小鼠交配，获得了CX3CR1-BAC-Cre-/-和CX3CR1-BAC-Cre+/-实验动物。此外，还有一只CX3CR1-BAC-Cre+/-雌性小鼠与tdTomato +/+雄性小鼠（stop-floxed）进行了交配。
顶叶皮层
在雌性而非雄性幼崽中持续表达CX3CR1-Cre会导致皮层中IBA1+小胶质细胞数量减少，表明小胶质细胞密度降低，这可能是由于表达IBA1的小胶质细胞数量减少所致（性别×基因型交互作用，F(1,32)=4.242；p<0.05；?ídák事后检验，p<0.05；图1C），同时IBA1+细胞体积也减小（基因型×性别交互作用，F(1,32)=5.567；p<0.05；?ídák事后检验，p<0.05；图1C）。
讨论
诱导型和持续型CX3CR1-Cre模型在研究小胶质细胞方面的广泛应用极大地推动了我们对小胶质细胞生物学的理解；然而，需要彻底评估其脱靶效应以确保研究结果的可靠性。先前的研究已经描述了诱导型CX3CR1YFP-CreER(Litt)表达在小胶质细胞中的意外后果，并警告不要在出生后早期进行诱导。
研究的局限性
在本研究中，我们未检测Cre表达对小胶质细胞免疫功能的直接影响，对持续型CX3CR1-BAC-Cre表达对小胶质细胞介导的IFN-1信号激活的影响进行详细分析可能会提供更多见解。然而，我们的模型中未检测到显著的DNA损伤，而DNA损伤是诱导型Cre模型中IFN-1信号激活的触发因素[22]。因此，我们不认为我们的模型中会显著激活小胶质细胞的IFN-1信号。
作者贡献声明
Jessica L. Bolton：撰写——审稿与编辑、初稿撰写、数据可视化、项目管理、方法论设计、实验设计、资金获取、数据分析、概念化。Urjoshi Kar：撰写——审稿与编辑、实验设计、数据分析。Fadya H. Mroue-Ruiz：撰写——审稿与编辑、初稿撰写、数据可视化、项目管理、方法论设计、实验设计、数据分析。Madison M.
利益冲突声明
? 作者声明以下可能被视为潜在利益冲突的财务利益/个人关系：Jessica L. Bolton表示获得了国家心理健康研究所（National Institute of Mental Health）的财务支持；Jessica L. Bolton还获得了Whitehall基金会和Brain & Behavior Research Foundation的财务支持。如果还有其他作者，他们声明没有已知的财务利益冲突。
致谢
本工作得到了NIH资助（项目编号R00 MH120327）、Whitehall基金会（资助编号2022-08-051）以及NARSAD（来自Brain & Behavior Research Foundation和The John and Polly Sparks Foundation的青年研究员资助#31308的支持。我们感谢Logan Ouellette和Sylvie Call提供的技术支持，以及乔治亚州立大学动物资源部门出色的动物护理。同时，我们也感谢乔治亚州立大学的成像核心设施提供的帮助。
