《Biochemical Engineering Journal》：Facilitating superior delignification, enhanced enzymatic hydrolysis, and robust ethanol fermentation of poplar sawdust through lysine-based ternary deep eutectic solvent pretreatment
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本研究开发了一种由CTAB、EA和Lys组成的ternary DES，用于松木屑预处理。结果显示，该DES显著提高木质素（87.2%）和半纤维素（99.9%）去除率，纤维素可消化性提升至96.0%，乙醇产量达89.9%。其机制在于Lys的氨基和羧基形成三维氢键网络，选择性破坏木质素结构，同时保持纤维素完整性，并具备高可回收性，为可持续生物精炼提供新方案。
魏唐|钱浩杰|王新月|王佳佳|张佳明|黄曹兴|范博|何宇才
中国江苏省常州市常州大学药学院与生物与食品工程学院，邮编213164
摘要
基于氨基酸的深共晶溶剂（DES）已成为一类典型的碱性DES，以其能够在温和条件下有效去除木质纤维素中的木质素而闻名，从而提高了生物精炼的经济可行性。本研究介绍了一种创新的三元DES，由溴化鲸蜡基三甲铵（CTAB）、乙醇胺（EA）和赖氨酸（Lys）组成，专门用于杨木锯末（PS）的预处理。实验结果表明，赖氨酸浓度的增加逐渐降低了溶液的pH值、电导率和极性，同时显著增强了氢键供体和受体的能力。赖氨酸中的氨基和羧基协同作用，形成了一个坚固的三维氢键网络。具体而言，DES预处理显著改善了PS的分离效果：与不含赖氨酸的对照组相比，加入赖氨酸后木质素的去除率从42.2%提高到87.2%，木聚糖的去除率从78.5%提高到99.9%。同时，纤维素的消化率从65.5%提高到96.0%，乙醇的产率从56.3%提高到89.9%。结构分析显示，赖氨酸显著促进了木质素键的选择性断裂，从而破坏了木质素的骨架。这种重组减少了木质素的比表面积，提高了纤维素的暴露程度，并增强了酶促水解效果。值得注意的是，该DES具有优异的可回收性。这些发现突显了碱性DES在可持续生物精炼和林业生物质资源利用方面的巨大潜力。
引言
木质纤维素生物精炼技术是一种跨学科的创新，通过结合预处理、酶促水解和发酵等集成技术，为应对全球能源需求和环境问题提供了有希望的途径[1]。该技术能够将未充分利用的木质纤维素生物质转化为高价值的生物衍生物，如C2-C6醇类和短链羧酸[2]。然而，由于木质素-碳水化合物复合体的固有阻力，这一技术的广泛应用受到阻碍，这阻碍了生物质的有效分解。在众多技术障碍中，预处理方法对不同原料的适应性不足是一个关键瓶颈，严重影响了生物精炼的经济可行性。以中国年产量超过800万吨的杨木产业为例，其加工过程中产生的锯末具有显著的地域集中性和成分一致性，其中纤维素含量为42-49%，木聚糖含量为19-24%，木质素含量为27-31%。这些特性使得杨木锯末成为设计和实施定制化生物精炼预处理系统的理想原料[3]。高效利用杨木锯末不仅提升了杨木产业的经济价值，也为其他快速生长的木材物种的循环经济框架奠定了基础。
杨木预处理技术已经形成了一个逐步发展的体系，但仍存在一些关键瓶颈。物理方法（如微波辐照、蒸汽爆炸和球磨）虽然能够破坏木质纤维素结构，但能量效率低且生物质转化率低[4]；三阶段涡流研磨虽然能有效破碎细胞壁，但会导致10-15%的纤维断裂；蒸汽爆炸可以降解约75%的半纤维素，但需要严格控制水分和蒸汽饱和度以防止自燃[5]。生物预处理虽然环保，但处理时间较长（GM菌株培养需28天），酶成本较高（每克纤维素需30 IU的纤维素酶），且木质素选择性较差（半纤维素保留率为82%），导致酶促水解效率波动较大[6]。相比之下，化学预处理在杨木生物质的大规模工业处理中显示出巨大潜力[7]。过氧乙酸预处理显著提高了酶促水解效率[8]，但残留的木质素会导致纤维素酶的不可逆吸附，这是一个主要问题；稀硫酸-乙醇共预处理可以去除91%的半纤维素，但抑制剂浓度低于0.3 g/L时会导致后续水解效率下降12-15%[9]；氨纤维膨胀预处理可以实现82%的糖转化率，但要实现经济可行性，氨的回收率需超过96.5%，这对处理设备的密封性能提出了严格要求[10]。因此，开发高效、节能且环保的预处理溶剂成为克服杨木生物质高价值转化技术瓶颈的关键策略。
作为新型绿色溶剂，深共晶溶剂（DES）在生物质预处理领域展现出诸多优势[11]。这类溶剂通常通过氢键供体和受体之间的相互作用形成，具有低共晶点的混合物，并具有优异的物理化学性质[12]。在木质纤维素预处理过程中，DES能够有效破坏植物细胞壁内的氢键网络，从而高效断裂木质素中的β-O-4键[13]。此外，DES还能通过催化半纤维素多糖链中的糖苷键水解来去除半纤维素。由于DES的作用，纤维素的结晶度显著提高，表面形态变得更加多孔和不规则，从而使酶促水解效率提高了三倍以上[14]。根据DES中氢键供体（HBD）的酸碱性质，这类溶剂可分为酸性和碱性两类[15]。其中，碱性DES（ALK-DES）表现出显著的优势。例如，基于氯化胆碱/乙醇胺的ALK-DES即使在温和反应条件下也能有效溶解木质素。ALK-DES预处理不仅保持了纤维素和半纤维素的结构完整性，还避免了酸性DES常见的半纤维素过度去除和纤维素降解问题[16]。此外，ALK-DES具有很高的可回收性，并适用于多种原料，包括小麦秸秆和杨木[17]。尽管如此，二元DES存在固有的局限性：氢键供体主要限于有机酸或多元醇，而氢键受体多集中在季铵盐（如氯化胆碱）中，这限制了物理化学性质的调控，无法满足多样化的工业需求。另一个关键问题是优化某一性质往往会导致其他性质下降。例如，引入长链氢键供体以降低粘度通常会削弱氢键作用。为了解决这些瓶颈，引入第三组分的三元DES被证明是一种有效策略，可以协同调节氢键网络和宏观性质。基于此，本研究开发了一种新型碱性三元DES，创新性地引入了赖氨酸作为双功能组分：其氨基和羧基能够增强和重构系统的氢键网络多样性和强度。该设计旨在在保持足够流动性的同时，提升溶剂的溶解能力。先前的研究已经证明了赖氨酸在ALK-DES中的重要作用，其中赖氨酸残基的氨基作为强氢键受体，有助于形成碱性环境[18]，这种环境不仅促进了木质素的有效降解，还保持了纤维素结构的完整性。赖氨酸侧链中的羧基对半纤维素具有选择性亲和力，从而提高了系统的选择性[19][20]。这种设计使得在温和条件下（70°C，9 h）实现高效预处理，且溶剂可多次重复使用，三次使用后的预处理效果仍接近60%。基于我们团队之前发现溴化鲸蜡基三甲铵（CTAB）在DES中的高效应用，本研究采用了赖氨酸、CTAB和乙醇胺（EA）的组合，开发了一种新型ALK-DES，旨在拓宽ALK-DES的应用范围，并为类似溶剂的进一步研究提供参考。
本文对由CTAB、EA和赖氨酸合成的DES进行了深入分析和全面表征，以揭示其与对照组相比的独特物理化学性质。随后，将这种DES用于杨木锯末的预处理，并通过酶促水解性能对其效果进行了严格评估。通过研究纤维素的可及性、木质素表面形态、官能团变化和结晶度变化，探讨了这种创新DES破坏木质纤维素复杂结构的作用机制。最终，通过同时糖化和发酵（SSF）技术成功从预处理的杨木锯末中生产出了生物乙醇。本研究旨在推进氨基酸在预处理中的应用，并扩展DES在可持续生物精炼领域的潜力。
材料
杨木锯末来自江苏省苏倩市。CTAB由上海阿拉丁生化科技有限公司提供。赖氨酸购自上海麦克林生化技术有限公司（中国）。乙醇胺（EA）来自上海新华制药试剂集团。直接红28染料和Azure B染料购自Sigma-Aldrich（上海）。纤维素酶（Cellic? CTec2，滤纸活性为186 FPU/g）由诺维信公司（美国）提供。所使用的Pichia pastoris菌株
pH值和电导率
pH值是衡量DES酸碱性的关键参数，对它们的化学稳定性和功能多样性具有重要影响[30]。如表1所示，不含赖氨酸的CTAB:EA混合物的pH值为14.1。乙醇胺是一种强有机碱，可提高介质中的氢氧根离子浓度。同时，乙醇胺通过与CTAB的分子自组装形成了稳定的氢键网络，有效固定了OH?离子
结论
由CTAB、EA和赖氨酸组成的三元DES表现出出色的构建氢键网络的能力，其中赖氨酸的氨基和羧基共同作用，显著增强了分子间氢键的稳定性和密度。在杨木锯末预处理过程中，该DES表现出优异的组分分离效率，大大提高了SSF过程中的乙醇产率。当CTAB:EA:赖氨酸的摩尔比为1:8:4时，...
CRediT作者贡献声明
王新月：数据分析、数据整理。钱浩杰：验证、软件处理。魏唐：初稿撰写、资源协调、项目管理、概念构思。何宇才：撰写、审稿与编辑、资源获取。范博：撰写、审稿与编辑。黄曹兴：撰写、审稿与编辑。张佳明：数据分析、数据整理。王佳佳：数据分析。
利益冲突声明
作者声明没有已知的财务利益冲突或个人关系可能影响本文的研究结果。
致谢
作者感谢国家自然科学基金青年项目（32301531）、江苏省前沿科学技术项目（BF2025080）、江苏省高等学校基础科学（自然科学）研究项目（23KJB220001）、常州市“龙城人才计划”第四批领军型创新人才引进项目（CQ20230084）等对本文研究的财政支持。
