用于表征荧光配体与毒蕈碱型乙酰胆碱M1受体结合的动力学分析

《Biochemical Pharmacology》：Kinetic assays to characterize fluorescent ligand binding to muscarinic acetylcholine M 1 receptor

本研究采用荧光偏振（FA）和荧光显微技术，利用荧光配体UR-MK342和UR-CG072研究M1受体配体结合动力学，发现UR-MK342亲和力更高且可监测变构调节作用，为开发选择性药物提供了新方法。

　　

T?nis Laasfeld | Hana Bláhovcová | Kaspar Hollo | Santa Veiksina | Ago Rinken | Anni Allikalt

塔尔图大学化学研究所，Ravila 14a，50411 塔尔图，爱沙尼亚

摘要

毒蕈碱型乙酰胆碱受体（M₁–M₅）属于G蛋白偶联受体（GPCRs）超家族，它们在调节关键生理过程中起着至关重要的作用，并成为药物研究中的重要靶点。M₁亚型主要存在于中枢神经系统中，与神经退行性疾病的病理生理学密切相关。近年来，荧光技术被频繁用于研究配体-受体相互作用。其中，荧光各向异性（FA）测定法作为一种均匀的测定方法，被用于测量配体结合动力学。在本研究中，我们使用荧光配体UR-MK342和UR-CG072（先前已证实能与毒蕈碱型乙酰胆碱受体结合）对M₁受体进行了FA测定。此外，我们还应用相同的配体进行了动力学荧光显微镜实验。研究结果表明，荧光配体UR-MK342在两种测定方法中均表现出更高的结合亲和力和更好的动态范围。随后，我们利用UR-MK342评估了十三种经典毒蕈碱型乙酰胆碱受体配体及三种别构调节剂的表观结合亲和力（pK_i），并将所得结果与现有文献进行了比较。值得注意的是，对竞争结合实验的在线监测表明其结合机制更为复杂，UR-MK342在别构调节研究中有潜在的应用价值。

引言

毒蕈碱型乙酰胆碱受体是G蛋白偶联受体（GPCRs）家族的膜蛋白，包括五种不同的亚型（M₁–M₅）。这些受体在由神经递质乙酰胆碱（ACh）调节的关键生理过程中起着关键作用。毒蕈碱型乙酰胆碱受体在心血管系统、消化系统、呼吸系统以及许多其他组织中的广泛分布，表明它们在维持人体内稳态方面不可或缺[1]。在这五种亚型中，M₁受体主要分布于大脑区域，对认知过程至关重要。此外，M₁亚型与阿尔茨海默病和精神分裂症的病理生理学密切相关[2]、[3]。近年来，越来越多的有前景的药物候选物在动物模型和临床试验中进行了测试。不幸的是，由于非选择性靶向外周毒蕈碱型乙酰胆碱受体，大多数候选物未能进入临床应用[4]、[5]。最近，一种新的治疗方法获得了批准，用于治疗精神分裂症，其机制不同于大多数现有抗精神病药物，因为它不主要针对多巴胺D₂受体[6]。该疗法结合了胆碱能药物Xanomeline（M₁和M₄受体的激动剂）和Trospium（外周限制性的毒蕈碱拮抗剂），能够有效缓解症状，同时显著减少不良反应[7]。这凸显了开发准确研究M₁受体功能、药理学和治疗潜力的测定方法的重要性。

在药物开发的初期阶段，必须对合适的配体进行充分的结合特性研究。在药理学研究中，研究人员通常关注候选药物的亲和力和选择性。放射配体结合测定等终点方法可以提供高质量的动力学参数，这些方法在毒蕈碱型乙酰胆碱受体家族的研究中尤为成功[8]。然而，仍存在一些实际限制。例如，实验过程往往较为繁琐，降低了通量。基于放射性的测定方法在大多数地区需要特殊许可和专用实验室空间。延长测量时间或频率以捕捉快速的动力学变化会增加化学物质的使用量、放射性废物的产生以及成本。然而，实时连续测量配体-受体相互作用可以提供更多的动力学数据，并更深入地了解配体与靶标的结合机制，同时避免了许多上述缺点。

为了便于表征配体结合动力学，开发了多种荧光技术。其中，荧光各向异性（FA）测定法是一种有效的方法：含有荧光标记配体的样品被平面偏振光激发。发射光的偏振程度取决于荧光配体的旋转自由度和荧光寿命——未结合的荧光配体在溶液中自由旋转，导致退极化（低FA），而结合在受体上的荧光配体对偏振光的改变较小（高FA）[9]。另一种方法是使用自动化荧光显微镜结合基于机器学习的图像分析流程，仅检测来自细胞膜的荧光强度（FI）[10]、[11]。这两种方法都能实现配体结合的连续监测，从而提供有关配体-受体复合物形成的宝贵信息，有助于研究配体的动力学特性。这些测定方法也适用于高通量筛选（HTS），可以在多孔板格式下进行样品测量，从而能够在不同实验条件下测试多种配体。获得的多变量数据集可用于建模配体与靶受体的相互作用机制。

上述荧光技术通常与不同的受体过表达系统结合使用。在FA测定中，常使用在Spodoptera Frugiperda（Sf9）昆虫细胞中产生的芽生杆状病毒（BBV）颗粒作为受体来源[12]。BBV颗粒具有均匀的粒径分布、低沉降速率和高稳定性，因此噪声较小，重复实验间的变异性低，甚至可以在FA测定中持续测量长达10小时。BBV颗粒还可以大规模生产并冷冻保存以备后续实验使用，无需在测量期间维持细胞培养。然而，BBV颗粒的膜成分与哺乳动物系统不同，缺乏下游信号分子（如G蛋白、GPCR激酶或阿瑞斯汀）。为克服这些缺点，也可以使用转染了目标受体基因的中国仓鼠卵巢（CHO）细胞进行荧光显微镜实验。

涉及毒蕈碱型乙酰胆碱受体的药物开发受到设计亚型选择性配体的挑战。在已知的数千种配体中，只有少数具有亚型选择性[13]，因为毒蕈碱型乙酰胆碱受体的结合位点结构高度保守[14]、[15]、[16]。然而，据报道毒蕈碱型乙酰胆碱受体具有不同的别构结合位点，这些位点可能被用于开发亚型选择性配体[17]。研究表明，通过别构位点选择性激活M₁受体可能为治疗神经退行性疾病的症状提供新的方法[17]。因此，开发有助于深入了解别构调节剂的配体结合测定方法至关重要。

此前，已经合成了一组荧光标记的二苯并二氮卓酮类毒蕈碱型乙酰胆碱受体配体[18]。其中，两种TAMRA（5-羧基四甲基罗丹明）标记的配体UR-MK342和UR-CG072（图1）由于TAMRA荧光团的适当荧光寿命和高结合亲和力，适用于FA测定[18]。这两种荧光配体已用于基于FA和BRET的测定方法，研究其与M₂受体的结合[19]。同样的配体也用于M₄受体的FA和荧光显微镜实验[11]。这两种荧光配体也被证实对M₁受体具有高亲和力[18]，使其适用于建立基于荧光的M₁受体测定方法。使用相同的标记配体可以在不同条件下直接比较不同毒蕈碱型乙酰胆碱受体亚型之间的配体结合情况。

上述两种荧光配体设计为双位点（bitopic）化合物，能够同时结合受体的正构和别构位点。一些经典的毒蕈碱型乙酰胆碱受体别构调节剂（如加兰明、LY2119620或烷基双铵化合物（例如W84）则结合在受体的第二和第三胞外环之间[20]。从结构上看，这些荧光配体足够大，可以到达别构位点[21]。我们之前使用UR-MK342进行的M₂受体FA测定数据也表明存在多个不同的配体结合位点[22]。因此，本研究的一个目标是测试UR-MK342荧光配体是否可用于与别构调节剂的竞争结合实验。此外，未标记的双位点配体已被证明可以与已知的M₂受体正构和别构配体竞争[23]。双位点化合物可能提高亚型选择性，因此这些化合物也被纳入了本研究中的实验。

FA测定用芽生杆状病毒（BBV）的制备

Sf9（Invitrogen，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆）细胞在非湿润环境中，使用EX-CELL? 420无血清培养基（Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易斯）在27°C下培养。通过添加0.2%的台盼蓝（Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易斯），使用Automated Cell Counter TC10?（Bio-Rad Laboratories，美国加利福尼亚州赫拉克勒斯）测定所有细胞培养物的密度和存活率。

人类毒蕈碱型乙酰胆碱M₁

结果

本研究采用基于荧光的测定方法研究M₁受体，无需对受体本身进行任何标记或结构修饰。然而，目前可用于M₁受体的荧光配体较少。先前发表的数据表明，UR-MK342和UR-CG072对毒蕈碱型乙酰胆碱M₁、M₂和M₄受体的结合亲和力较高[18]。对于其他亚型，亲和力较低，因此需要开发针对M₃和M₅受体的FA测定方法

讨论

本研究展示了两种互补的基于荧光的方法——荧光各向异性（FA）和荧光显微镜——用于实时动力学分析毒蕈碱型乙酰胆碱M₁受体上的配体-受体相互作用。这些方法提供了高时间分辨率的结合动力学表征工具，提供了比传统终点测定更深入的见解。

荧光测定方法为动力学测量提供了独特的可能性

写作过程中生成式AI和AI辅助技术的声明

在撰写本文过程中，作者使用了ChatGPT和Microsoft Copilot来提高手稿的可读性和语言表达，并作为软件开发辅助工具。使用这些工具/服务后，作者根据需要对内容进行了审查和编辑，并对发表文章的内容承担全部责任。

未引用的参考文献

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CRediT作者贡献声明

T?nis Laasfeld：撰写 – 审稿与编辑，初稿撰写，可视化，软件开发，方法学研究，数据分析，概念化。Hana Bláhovcová：撰写 – 审稿与编辑，可视化，验证，方法学研究，数据分析，形式分析。Kaspar Hollo：撰写 – 审稿与编辑，初稿撰写，可视化，验证，软件开发，方法学研究，数据分析，形式分析。Santa Veiksina：撰写 –

利益冲突声明

作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文的研究结果。

致谢

我们感谢Max Keller博士提供荧光配体UR-MK342和UR-CG072，以及Jan Jakubik教授提供表达人类毒蕈碱型乙酰胆碱M₁受体的细胞（CHO-M1），同时感谢Mari-Liis Tsernant、Jane Torp、Maris-Johanna Tahk博士和Lukas Gr?tz博士在实验方面的支持。本研究得到了爱沙尼亚研究委员会的资助（PSG912）。此外，COST Action CA18133/欧洲信号转导研究网络（ERNEST）也提供了支持