《Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes》：Structure/function relationships of mitochondrial protein carrier (SLC25A20) for carnitine/acylcarnitine: A review
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肉碱穿梭体（CAC）是线粒体内膜运输酰基肉碱的关键蛋白，通过反转运机制促进脂肪酸β-氧化和ATP生成。本文系统综述了30年来对CAC结构特征的研究进展，包括其三维构象的预测和瞬时二聚化特性，揭示了CAC与通道化运输及代谢协同调控的分子机制。研究指出CAC功能障碍可导致心肌病、糖尿病肾病和癌症代谢重编程等疾病，为开发靶向治疗策略提供理论基础。
Nicola Giangregorio|Annamaria Tonazzi|Lara Console|Cesare Indiveri
CNR生物膜、生物能量学和分子生物技术研究所（IBIOM），Via Amendola 122/O，70126，巴里，意大利
摘要
线粒体肉碱/酰基肉碱载体（CAC）属于线粒体载体（MC）家族。它通过将酰基肉碱转运到线粒体基质中来交换肉碱，在线粒体肉碱穿梭过程中起着关键作用，对脂肪酸氧化和ATP的产生至关重要。本文综述了三十年来我们在CAC结构特征研究方面的进展。尽管CAC的晶体结构尚未确定，但多项体外和计算机模拟（in silico）研究（其中许多研究利用了ADP/ATP载体在细胞质和基质两种构象下的三维结构）为理解底物转运的分子机制提供了宝贵见解，支持所有线粒体载体都共享基于单一结合位点的门控机制的假设。此外，我们还讨论了CAC的瞬时二聚化现象以及其形成的具有通道功能的超分子复合物。最后，本文对CAC的机制分析可能为开发针对CAC功能受损患者的新治疗策略奠定基础。
引言
线粒体肉碱/酰基肉碱载体（CAC，SLC25A20）属于一类转运蛋白（人类中有53个成员），这类转运蛋白主要通过转运系统将氨基酸、核苷酸、有机酸和辅酶等物质跨线粒体内膜（IMM）运输[1]。CAC催化一种反向转运反应，将酰基肉碱转运到线粒体基质中（其中定位有脂肪酸β-氧化的酶），同时将肉碱释放到细胞质中[2]、[3]。线粒体内的酰基链氧化产生还原当量，为氧化磷酸化提供能量，这是整个细胞能量平衡的关键过程[4]、[5]。线粒体脂肪酸β-氧化（FAO）在禁食或心脏、肺、肝脏等高能量需求组织中对于产生代谢能量非常重要。
CAC是线粒体肉碱穿梭系统的核心组成部分（图1），对于将长链酰基肉碱转运到线粒体基质进行β-氧化至关重要。SLC25A20（OMIM: 613698）编码一种普遍表达的线粒体内膜载体，其核心结构特征（包括底物结合位点）和转运机制在各种组织中高度保守，这与其在线粒体长链脂肪酸代谢中的关键作用一致[1]、[2]、[6]。CAC的结构或功能异常会损害线粒体脂肪酸氧化（FAO），导致脂肪酸和酰基肉碱在细胞质中积累。SLC25A20的突变会导致一种严重的常染色体隐性遗传代谢疾病，伴有继发性肉碱缺乏[7]、[8]。这种情况并非由于饮食中肉碱吸收不良，而是由于肉碱穿梭机制受损，特别是酰基肉碱向线粒体的转运受阻以及β-氧化功能受损[8]。因此，CAC功能障碍会导致细胞能量不足、有毒脂质中间产物的积累和线粒体功能障碍。该疾病通常在生命早期表现为心肌病、呼吸窘迫、肝功能异常、低酮血症性低血糖，在严重情况下甚至会导致婴儿猝死[9]、[10]、[11]、[12]、[13]。由于许多组织严重依赖FAO来产生ATP，CAC功能障碍会对特定器官产生显著影响。心脏尤其脆弱，因为心肌细胞严重依赖FAO来供能。CAC活性缺陷会导致心肌能量不足、脂毒性心肌病、钙处理异常，并增加心力衰竭的风险，临床上常与肥厚型或扩张型心肌病、心律失常和猝死相关[6]、[14]、[15]。肝脏功能障碍可能由于禁食期间酮体生成受损而发生，从而引发低酮血症性低血糖和肝脂肪变性[16]、[17]。骨骼肌受累时可能出现肌肉无力或横纹肌溶解[6]、[15]。除了遗传缺陷外，越来越多的证据表明CAC功能障碍与常见代谢疾病有关。在糖尿病和胰岛素抵抗中，CAC功能障碍导致的FAO能力下降会促进长链酰基辅酶A（acyl-CoA）和酰基肉碱在细胞内的积累，这些物质通过激活PKC亚型（如蛋白激酶C-α和蛋白激酶C-θ[18]、JNK（c-jun氨基末端激酶）[20]以及NF-κB（活化B细胞的核因子κ-light-chain增强子）通路[21]干扰胰岛素信号传导，从而加重代谢炎症和胰岛素抵抗。FAO不完全还会增加线粒体活性氧（ROS）的产生和氧化应激以及线粒体DNA损伤[6]、[22]。CAC还通过调节胰腺β细胞中的底物利用来参与胰岛素分泌的调控，在肥胖和糖尿病中其表达可受microRNA的调控[23]。CAC介导的FAO受损也与糖尿病肾病（DKD）有关，疾病进展过程中肾小管上皮细胞会受损。脂肪酸转运蛋白CD36的上调会显著增加近端小管对脂肪酸的摄取。当CAC功能因线粒体功能障碍、氧化应激或肉碱缺乏而受损时，线粒体脂肪酸β-氧化不足以处理增加的脂质流入，多余脂肪酸会转化为有毒脂质中间产物（如二酰基甘油和神经酰胺）。这些脂毒性物质会激活转化生长因子-β（TGF-β）/SMAD信号通路，诱导内质网（ER）应激反应，并促进促纤维化转录程序，最终导致肾小管上皮损伤、小管萎缩和间质纤维化[24]、[25]。CAC功能障碍还会加剧线粒体ROS的产生，抑制PPARα依赖的FAO基因转录，并通过NF-κB放大炎症信号[24]、[25]。因此，CAC功能障碍与CD36介导的脂质过载共同加剧糖尿病中的肾脏损伤，揭示了肉碱代谢异常与DKD进展之间的机制联系。在癌症中，CAC表达的改变会影响代谢重编程[26]、[27]。某些肿瘤会下调CAC以抑制FAO并促进糖酵解和脂质储存，而另一些肿瘤则会上调CAC以支持代谢应激下的FAO依赖性生存。因此，CAC活性的异常会影响氧化还原平衡、NADPH的可用性和细胞对凋亡的抵抗力，从而影响肿瘤生长和治疗反应[28]、[29]。在胰腺导管腺癌（PDAC）中，观察到FAO、ATP产生和癌细胞增殖之间存在强烈相关性[30]。值得注意的是，敲低癌细胞中的SLC25A20可显著降低ATP水平并抑制细胞生长，因为mTOR（一种调节细胞生长和增殖的丝氨酸/苏氨酸激酶）被失活。这种能量耗竭最终会触发细胞凋亡[31]。也有研究表明肉碱转运与生育能力之间存在关联[32]。CAC功能障碍通常还会伴随其他临床和生化特征，例如血浆酰基肉碱谱型显示长链酰基肉碱（尤其是C16（棕榈酰肉碱）、C18（硬脂酰肉碱）和C18:1（油酰肉碱）的积累。偶数编号长链物种的升高反映了线粒体对长链脂肪酸转运的受损。相比之下，短链和中链酰基肉碱通常正常或仅受次要影响。由于长链酰基肉碱的积累和肉碱循环受阻，游离肉碱（C0）水平通常降低。这些生化特征被广泛用于新生儿筛查，有助于早期识别CAC缺乏[33]。
癌细胞根据代谢表型和微环境的不同，表现出不同的CAC调节机制。这些组织特异性的能量需求、脂质处理和转录调控（例如PPARα信号通路）差异有助于解释为什么CAC功能障碍会在不同器官中导致不同的临床表现[1]、[6]、[14]、[17]、[34]。
本文将通过功能性实验、定点突变和化学方法以及计算机模拟（in silico）分析来探讨CAC的结构/功能关系，以阐明其在线粒体中参与的重要代谢过程。
部分内容摘要
CAC的一级结构
在过去三十年中，我们深入研究了CAC的结构特性。
最初，我们通过克隆和序列分析阐明了该载体的一级结构[35]。首先使用基于纯化的大鼠CAC肽部分氨基酸序列数据的简并引物通过PCR技术鉴定出CAC的DNA。随后克隆了大鼠CAC cDNA，其开放阅读框为903 bp，编码一个由301个氨基酸组成的蛋白质[35]。
CRediT作者贡献声明
Nicola Giangregorio：验证、监督、概念构思、撰写及审稿编辑。Annamaria Tonazzi：数据可视化、数据管理、撰写及审稿编辑。Lara Console：验证、数据管理、撰写及审稿编辑。Cesare Indiveri：验证、资金获取、概念构思、撰写及审稿编辑。
资助
“SI.F.I.PA.CRO.DE. — 个性化分子治疗的创新药物开发与工业化 PA.CRO.DE。”该项目由意大利大学与研究部（MUR）资助（项目编号：ARS01_00568），资助对象为Cesare Indiveri。
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的可能会影响本文所述工作的财务利益或个人关系。
